鸡毒支原体又称鸡败血霉形体,主要感染鸡和火鸡,引起鸡的慢性呼吸道系统传染病,是现阶段养殖业较为严重的疾病之一。泰乐菌素作为动物专用药,对畜禽的呼吸道疾病具有良好的治疗作用,并且不易产生药物残留,毒性作用弱,具有极高的安全性,进一步促进了其在兽医临床上的应用。我国目前养殖业用药的不合理已经导致耐药现象的产生,耐药检测具有必要性和紧迫性。为了减缓鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药性产生,保护和维持泰乐菌素的有效性,需要对鸡毒支原体开展耐药监控措施。耐药判定标准是对细菌进行有效耐药监控的科学手段,是判断细菌耐药性的科学准则。因此,为了监测耐药性产生,分析耐药现状和发展规律,更科学的指导临床用药,本课题参考CLSI中耐药判定标准制定的方法建立符合我国国情的野生型临界值、PK-PD临界值和临床临界值,为耐药判定标准的制定工作提供科学数据。1.泰乐菌素对鸡毒支原体的野生型临界值（COWT）的制定本实验从临床感染鸡只中分离鸡毒支原体107株,与实验室保存的标准菌株4株共111株鸡毒支原体。采用肉汤稀释法测定了泰乐菌素对111株鸡毒支原体的最小抑菌浓度（MIC）,结果显示MIC50为0.5 μg/mL,MIC90为2 μg/mL。将得到的MIC数据带入Ecoffinder软件,进行线性回归模拟,得到不同置信区间下的野生型临界值。根据ECOFFinder软件分析结果显示,95.0%和97.5%的Subset ECOFF都为2μg/mL,所以选择2 μg/mL为最终的野生型临界值。2.泰乐菌素对鸡毒支原体的药效学临界值（COPD）的制定结合体外药效学数据,选取了 MIC90的菌株进行SPF级鸡胚毒力实验,最终选择M 17菌株进行PK-PD试验,制定药效学临界值。使用微量肉汤稀释法测定泰乐菌素对鸡毒支原体M 17在FM-4肉汤、鸡血浆和肺组织中的MIC和最小杀菌浓度（MBC）,结果显示在肉汤、鸡血浆和肺组织中的MIC都为2 μg/mL,MBC都为4μg/mL;用琼脂稀释法测定泰乐菌素对鸡毒支原体M 17的防突变浓度（MPC）,测得MPC为5.12 μg/mL;采用菌与药孵育后去除的方法测定泰乐菌素对鸡毒支原体的体外抗菌后效应（PAE）,测得孵育1 h的PAE为1.55～2.32 h,孵育2 h的PAE为4.24～4.92 h。根据MIC测定结果,设置不同浓度的泰乐菌素药物分别与鸡毒支原体M 17孵育,在不同时间点进行滴度测定,绘制泰乐菌素对鸡毒支原体M 17的体外杀菌曲线。根据泰乐菌素给药后不同时间点中血浆和肺组织中的药物浓度,在空白血浆和肺组织中加入相应浓度的药物,与鸡毒支原体M 17孵育,绘制半体内血浆杀菌曲线和半体内肺组织杀菌曲线。通过PAE和半体内杀菌曲线研究,发现泰乐菌素对鸡毒支原体的抗菌作用主要呈现为一定的浓度依赖型和长时间依赖型,所以最后选择的PK-PD 参数是 AUC/MIC。试验选取112羽3周龄的白羽肉鸡,随机分为2组,健康组和人工感染组各56只。人工感染组用鸡毒支原体M 17进行气管灌注,感染7天建立鸡毒支原体患病模型。健康组和患病组均以25 mg/kg b.w.的给药剂量灌胃给药酒石酸泰乐菌素可溶性粉,给药后 0.33、0.67、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、36 和 48 h 采集鸡血浆和肺组织,经样品前处理后用高效液相色谱法检测不同时间点泰乐菌素的浓度。采用WinNonlin软件中的一级吸收二室模型对药动学数据进行拟合,得到泰乐菌素在健康鸡和患病鸡靶组织肺中的药动学参数:峰浓度（Cmax）分别为6.284和6.174 μg/mL,24 h药时曲线下面积（AUC24h）分别为35.569和60.949 h.μg/mL,达峰时间（Tmax）分别为2.079和2.107 h,吸收半衰期（T1/2α）分别为1.512和1.403 h,消除半衰期（T1/2β）分别为1.700和21.737 h,清除率/生物利用度（CL/F）分别为0.703和0.410 mL/kg/h。利用抑制型Sigmoid Emax模型对半体内条件下健康组和患病组的AUC24h/MIC值与鸡毒支原体数量变化的对数值进行拟合,得到健康组和患病组的模型参数:Emax分别为 2.17 和 2.20,E0 分别为-4.59 和-4.53,EC50 分别为 27.40 和 27.68。预防（E=0）、治疗（E=-3）和根除（E=-4）目的下AUC24h/MIC靶标值:健康组依次为18.98、48.84、86.59 h;患病组依次为19.25、51.19、95.26 h。由于患病组更贴近实际用药对象,按照患病组 AUC24h/MIC 的靶标值,根据剂量计算公式:（?）,得到当泰乐菌素对鸡毒支原体的MIC为2 μg/mL,临床推荐的按体重给药的预防剂量为17.25 mg/kg,治疗剂量为45.88 mg/kg,根除剂量为85.37 mg/kg。基于细菌的生长动力学机制的PK-PD模型进行不同给药方案下的疗效预测得到治疗剂量下以24h给药间隔,连续给药3天能达到预期疗效。临床推荐采用混饲给药,为方便临床用药,预防、治疗和根除日给药剂量对应的混饲剂量分别为 170、460 和 850mg/kg。利用Winnonlin模拟得到患病组E=-3时对应的药动学靶值为51.19,从而计算在不同MIC下的达标率。由患病肺组织的模拟结果可知,当MIC为2μg/mL时,达标率为0%;当MIC为1 μg/mL时,达标率为93.68%,高于90%。根据药效学临界值制定规则,达标率在90%以上所对应的最大MIC值即为药效学临界值,因此最终制定的泰乐菌素对鸡毒支原体的药效学临界值为1 μg/mL。3.泰乐菌素对鸡毒支原体的临床临界值（COCL）的制定结合体外药效学数据,选取了 5个不同的MIC的菌株进行SPF级鸡胚毒力实验。最终选择 M 1（MIC 0.008 μg/mL）、M 11（MIC 0.03 μg/mL）、M 17（MIC 2 μg/mL）、M 23（MIC 1 μg/mL）和M 24（MIC 0.5 μg/mL）菌株进行临床治疗试验,制定临床临界值。试验选取165羽3周龄普通白羽肉鸡随机分为11组,每组15只。人工感染菌株选用筛选的5个不同的MIC菌株M1、M 11、M 17、M 23和M 24,每株菌人工感染2组,空白1组,人工感染后每株菌治疗一组,治疗方案采用PK-PD推荐的给药方案,45.88 mg/kg b.w.,1天1次,连续给药3天。以1×109CCU的剂量,气管灌注1 ml鸡毒支原体进行人工感染,连续感染7天。感染给药后密切观察鸡的状况,统计实验治愈率。临床试验中,得到泰乐菌素对上述5株菌株感染的鸡只的治愈率分别为100%、100%、93%、80%、73%,通过“WindoW”算法分析模型确定临床临界值的分布范围为0.03-1 μg/mL,通过CART算法分析模型确定临床临界值的分布范围为小于0.75 μg/mL,最后通过非线性回归分析方法确定临床临界值的分布范围为小于0.57μg/mL。最后确定的临床临界值为0.5 μg/mL.结合获得的野生型临界值、药效学临界值和临床临界值,根据CLSI折点的制定流程,最终建立鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药判定标准为2 μg/mL。