【研究背景】肝细胞癌(HCC)是全球常见的癌症之一,也是导致癌症死亡的主要原因。全球每年约有84.1万名患者被诊断为肝细胞癌。在中国,由于潜在肝病、晚期诊断和有限的治疗方法,肝细胞癌在癌症相关死亡原因中位居第三。肝癌其恶性程度高,进展较快。肝癌的复发转移是其治疗失败的主要原因之一。流行病学统计结果显示,酒精是肝癌发生发展过程中的重要危险因素之一。前期大量的研究主要集中在酒精代谢过程中的主要产物乙醛的氧化应激作用对疾病的影响。然而现在越来越多的研究表明,酒精的代谢影响着DNA的甲基化和去甲基化的过程。DNA甲基化即在甲基转移酶的作用下催化胞嘧啶生成5-甲基胞嘧啶(5m C)。异常模式的DNA甲基化,这一重要的表观遗传机制的转录调控与肿瘤的发生发展密切相关。TET(ten-eleven translocation)蛋白家族是一组能够调节表观遗传反应的DNA脱甲基酶,可将5-甲基胞嘧啶(5m C)转化为5-羟甲基胞嘧啶(5hm C),该过程是DNA去甲基化的1个必要阶段。本课题组前期的研究结果发现慢性酒精应激可以引起多种mi RNAs谱表达差异。micro RNAs(mi RNAs)是一种内源性的非编码小RNA,在基因表达调控中发挥重要作用。在一定条件下,mi RNA既可以作为癌基因,也可以作为肿瘤抑制因子。失调的mi RNA已经被证明会影响癌症的多种特征,维持增殖信号、逃避生长抑制因子、抵抗细胞死亡、激活侵袭和转移以及诱导血管生成。我们将通过小鼠的肝癌原位移植模型来探讨酒精在肝癌进展过程中的作用,并通过Western blot、q-PCR对其过程中可能存在的机制进行探讨。进而揭示酒精诱导肝癌转移过程中可能存在的新的机制。【研究方法】(1)通过慢病毒转染,嘌呤霉素筛选,获得稳定表达绿色荧光蛋白的细胞株。(2)通过裸鼠肝癌原位移植模型,检测慢性酒精应激对肝癌进展的影响。(3)通过磁珠分选,荧光显微镜计数,检测裸鼠在饮酒五周、六周时外周血中的循环肿瘤细胞数。(4)通过H&E染色观察裸鼠原位移植模型中肺组织上转移灶的数目和大小。(5)通过免疫组织化学法检测肿瘤组织中TET2蛋白的表达情况。(6)通过western blot检测酒精慢性诱导不同时间段的肝癌细胞中TET2蛋白的表达水平,q-PCR检测mi RNA-22-3p的表达水平。(7)通过western blot检测肿瘤组织中TET2的表达水平,q-PCR检测肿瘤组织中mi R-22-3p表达水平。【研究结果】(1)成功构建HCCLM3/GFP稳定转染的细胞株。(2)慢性酒精应激促进肝肿瘤的增殖,肿瘤体积增加,肺组织表面的结节转移灶数目增多。(3)慢性酒精应激增加了小鼠外周血中循环肿瘤细胞的数目。(4)H&E染色结果发现慢性酒精应激后肺组织中的转移灶数目多,体积大,肺泡组织区域有更大面积的肿瘤细胞的浸润,有的肺泡组织区形成大的癌巢。(5)免疫组化实验结果发现慢性酒精应激使肝癌组织中TET2的蛋白表达水平降低。(6)在细胞水平,慢性酒精诱导不同时间段,TET2的表达水平下降,mi RNA-22-3p的表达水平升高。差异与诱导时间有关。(7)在慢性酒精诱导的肿瘤组织中TET2低表达,mi RNA-22-3p高表达。【结论】慢性酒精应激通过mi R-22-3p/TET2调节循环肿瘤细胞促进肝细胞癌的转移。