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貉细小病毒（Raccoon dog parvovirus,RDPV）感染引起貉病毒性肠炎,在貉群中的发病率和死亡率较高,对貉养殖业造成了巨大经济损失,严重制约了貉养殖业的健康发展。RDPV与猫细小病毒（Feline parvovirus,FPV）、水貂肠炎细小病毒（Mink enteritis virus,MEV）、犬细小病毒（Canine parvovirus,CPV）等细小病毒的亲缘关系密切。近年来,本实验室流行病学调查显示,一种新型RDPV在我国貉群中流行,其主要结构蛋白VP2上决定分型的关键氨基酸位点与2型CPV（CPV-2）的VP2上所对应的氨基酸一致,表明新型RDPV与CPV-2的亲缘关系最为密切,但新型RDPV的VP2蛋白4个氨基酸位点发生了突变,S27T、S297A、N375D和V562L,其中S27T是首次发现。目前暂无有关新型RDPV的特异性检测方法,并且国内无貉专用的商品化RDPV疫苗,临床上一般使用CPV灭活疫苗或MEV灭活疫苗对貉进行免疫接种,尽管具有一定免疫保护效果,但免疫失败的现象时有发生,这给新型RDPV的检测和防控带来了挑战。为此,本研究建立了新型RDPV双重PCR检测方法,同时制备了灭活疫苗。本研究参考Gen Bank上发表的RDPV、CPV、FPV和MEV等细小病毒的结构蛋白VP2基因序列,使用Snap Gene软件对相关序列进行分析比较,分别针对RDPV、CPV、FPV和MEV等细小病毒的VP2蛋白基因的保守区设计了一对通用引物P1-F/P1-R,针对新型RDPV设计了一对特异性引物P2-F/P2-R,建立了双重PCR检测方法。通用引物P1-F/P1-R目的片段大小为261 bp,特异性引物P2-F/P2-R目的片段大小为648 bp。对单重PCR反应扩增出的目的条带分别进行PCR产物回收与纯化、与pMD18-T载体连接、转化DH5α,提取质粒,进行酶切鉴定,筛选阳性重组子进行测序。结果表明,所设计的两对PCR引物特异性强。采用矩阵试验对引物浓度、退火温度和循环次数等PCR反应程序进行探索,最终确定了双重PCR反应的最佳条件,并进行了特异性试验、敏感性试验和重复性试验。结果表明,所建立的双重PCR检测方法特异性强、重复性好,通用引物P1-F/P1-R最低可检测到1.83×10~2copies/μL的病毒DNA;特异性引物P2-F/P2-R最低可检测到1.64×10 copies/μL的病毒DNA。进一步使用所建立的双重PCR检测方法对山东诸城、潍坊、东平等地20个貉养殖场送检的50份疑似貉病毒性肠炎的粪便与肠道样品进行了检测,结果35份样品双重PCR扩增阳性,与病毒分离培养检测结果符合率为100%。本研究表明,建立的双重PCR方法适用于新型RDPV的快速检测。选用新型RDPV东平分离株（RDPV-DP1）为种毒,研制了灭活疫苗。首先将RDPV-DP1在CRFK细胞上扩大培养,通过HA和TCID50试验对病毒液进行测定,病毒滴度HA效价2~7、106.4TCID50/mL。分别按照1:3,000、1:4,000、1:5,000和1:6,000的比例向病毒液中加入灭活剂β-丙内酯,4℃作用6、12、18和24 h,然后37℃水浴2 h使灭活剂β-丙内酯分解。将不同灭活条件的抗原液各500μL,分别接种CRFK细胞,盲传3代,若无细胞病变（CPE）产生,则判定为灭活完全。最终确定灭活剂β-丙内酯按1:4,000添加,4℃灭活24 h。取灭活完全的病毒液按2:1的比例与氢氧化铝佐剂混合,制备灭活疫苗。对所制备的灭活疫苗进行外观检验、无菌检测、稳定性检测和保存期检验。结果表明,所制备的灭活疫苗外观正常无沉淀杂质,无微生物污染,4℃至少保存6个月。安全性试验,将20只KM小鼠随机分成4组,每组5只,分别为常规剂量接种组、超剂量接种组、佐剂接种组和生理盐水接种组。常规剂量接种组每只小鼠接种0.3mL灭活疫苗,超剂量接种组每只小鼠接种0.6 mL灭活疫苗,佐剂接种组每只小鼠接种0.3 mL氢氧化铝佐剂,生理盐水接种组每只小鼠接种0.3 mL生理盐水。对所有实验动物进行临床观察、体温测定等。结果表明,各组实验动物临床表现正常,剖检无病理变化,表明所制备的灭活疫苗具有良好的安全性。然后对灭活疫苗的免疫原性进行检测,将72只KM小鼠随机分为3组,每组24只。在试验开始,对第1组和第2组每只小鼠分别经皮下接种灭活疫苗0.3 mL,在一免后14 d再对第2组小鼠以相同的方式进行第2次免疫接种。在第一次接种疫苗后第7、14、21和28 d,对实验动物进行采血、制备血清,采用HI试验检测抗RDPV抗体效价。结果,在14 d时第1组和第2组小鼠的HI抗体效价均在2~4以上,但在第21 d时,第一组小鼠HI抗体效价在2~5以上,但第2组小鼠HI抗体效价上升,平均2~6,在第28 d时,第1组小鼠HI抗体效价上升不明显,但第2组小鼠HI抗体效价上升,约2~7。结果表明,所制备的灭活疫苗能诱导机体产生良好的抗体水平,具备良好的免疫原性,2次免疫效果优于1次免疫效果,为貉细小病毒性肠炎的防控提供了一种潜在的选择。