【摘 要】
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Ⅱ型干扰素,也称干扰素-γ（IFN-γ）,是参与辅助性T淋巴细胞1（Th1）免疫应答的关键细胞因子之一。研究表明,鱼类与哺乳类Ⅱ型干扰素同源,不同的是真骨鱼类（Teleost）有两种Ⅱ型干扰素,即IFN-γ和干扰素-γ相关因子（IFN-γrel）。迄今,对鱼类IFN-γ基因的表达规律和功能已有大量报道,而对IFN-γrel的研究尚不深入,产生IFN-γ和IFN-γrel的细胞来源不清楚,它们是否有
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Ⅱ型干扰素,也称干扰素-γ（IFN-γ）,是参与辅助性T淋巴细胞1（Th1）免疫应答的关键细胞因子之一。研究表明,鱼类与哺乳类Ⅱ型干扰素同源,不同的是真骨鱼类（Teleost）有两种Ⅱ型干扰素,即IFN-γ和干扰素-γ相关因子（IFN-γrel）。迄今,对鱼类IFN-γ基因的表达规律和功能已有大量报道,而对IFN-γrel的研究尚不深入,产生IFN-γ和IFN-γrel的细胞来源不清楚,它们是否有功能差异也存在争议。本研究构建了原核重组表达质粒,在大肠杆菌DE3细胞表达,获得了表达原核重组Ci IFN-γ/IFN-γrel的基因工程菌。发现在DE3中表达的IFN-γ为可溶性蛋白;而IFN-γrel则为不可溶性蛋白。通过亲和层析和分子筛层析提取了高纯度重组Ci IFN-γ/IFN-γrel蛋白,分别制备了单克隆抗体并进行了初步鉴定。在真核系统CHO-S和HEK293F细胞中分别表达真核重组的Ci IFN-γ/IFN-γrel蛋白,刺激HKLs细胞后,通过q PCR检测IFN-γ和IFN-γrel对免疫基因的调节作用。通过表达Ci IFN-γrel硒代蛋白,解析Ci IFN-γrel的晶体结构,并通过Co-IP实验验证Ci IFN-γrel与受体的结合关系,具体研究结果如下:（1）本研究获得了高纯度重组IFN-γ和IFN-γrel蛋白,分别制备了单克隆抗体。通过Western Blotting筛选获得了4株特异性高、亲和力好的抗体,结果表明Ci IFN-γ单克隆抗体与Ci IFN-γrel没有交叉反应,反之亦然,其中FITC标记的两株抗体可用于免疫荧光和流式细胞术分析。此外,Western Blotting分析显示草鱼IFN-γ和IFN-γrel单克隆抗体不识别斑马鱼的同源Ⅱ型干扰素蛋白。（2）为进一步研究草鱼Ⅱ型干扰素的功能差异,本研究使用真核重组Ci IFN-γ/IFN-γrel刺激HKL 6 h和12 h,结果表明IFN-γ和IFN-γrel在6 h和12 h均可上调Il-1β和Cxcl8-l1的表达。相反,IFN-γ和IFN-γrel的刺激对Il-6没有上调作用。IFN-γ显著诱导Cxcl11.b基因表达,但IFN-γrel不能诱导。Mhc II和T-bet基因也观察到相同的效果。用IFN-γ和IFN-γrel刺激后,Stat1a表达水平没有改变。（3）本研究解析了Ci IFN-γrel的晶体结构,其是一种具有相同多肽链的同型二聚体,通过非晶体学双轴相连。每个多肽链由6个α螺旋组成,表示为A到F,由不同长度的环连接（由连接的螺旋指定）。主要依靠二硫键和分子间疏水性作用力维持二聚体结构的稳定性,与其他螺旋相比,C螺旋提供的包埋面积（BSA）最大。（4）Co-IP结果显示IFN-γrel与CRFB13和CRFB17有相互作用,与CRFB17的结合亲和力比CRFB13强。然而,IFN-γrel与CRFB6之间没有检测到相互作用。但CRFB6与CRFB13和CRFB17有相互作用。与野生型IFN-γrel相比,Gln23A、Thr31A、Glu76A和Asp128A的突变导致与CRFB13的结合减弱,而Gln45A和Lys93A的突变具有相反的效果。相比之下,突变型Arg29A与野生型IFN-γrel具有相当的结合亲和力。Asp128A突变位点是IFN-γrel与CRFB17结合的关键结合位点。（5）Ci IFN-γrel刺激的细胞中STAT1a的磷酸化以剂量依赖性方式增加,与野生型Ci IFN-γrel相比,用Arg29A、Thr31A、Gln45A、Lys93A和Asp128A突变体处理的细胞中STAT1a磷酸化水平降低,Gln45A检测到显著抑制。相反,Gln23A和Glu76A没有改变STAT1a磷酸化水平。q PCR结果显示Lys93A和Asp128A显著降低了Ci IFN-γrel诱导Il-1β和Cxcl8-l1表达的能力。总之,本研究获得了高纯度重组IFN-γ和IFN-γrel蛋白,制备了单克隆抗体。通过Western Blotting筛选获得了4株特异性高、亲和力好的抗体,可用于免疫荧光和流式细胞术分析。验证了IFN-γ和IFN-γrel的功能差异,解析了Ci IFN-γrel的晶体结构,为深入研究草鱼Ⅱ型干扰素的产生、生物学功能以及结构生物学奠定基础。
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