论文部分内容阅读
2010年10月以来,猪流行性腹泻在中国和世界其他主要养猪国家大面积流行。本论文首先对42株PEDV(2010年以后的PEDV中国流行株24个,美国流行株株7个,韩国毒株6个,参考毒株5个)S蛋白氨基酸序列进行比较,结果显示,与参考毒株相比,2010年以后PEDV流行株的S蛋白的22aa~380aa区域(命名为SA)为突变的集中区域;流行株亲缘关系较近且在一个分支,而疫苗株及早期毒株等参考毒株则位于另一个分支;早期毒株与中国现用疫苗毒株CV777之间的同源性较高,为95.0%~99.1%,而2010年后的流行株与参考毒株间的同源性为92.3%~94.1%,其中与疫苗株CV777的同源性仅为93.3%;对SA区域进行抗原位点与糖基化位点的预测发现,2010年以后流行株与疫苗株及早期毒株之间在22aa~380aa之间抗原位点差异较大,且在60aa~280aa之间差异最显著;2010年以后的毒株在62aa~65aa位多出了一个N糖基化位点。以上结果提示2010年以后的PEDV流行株与经典毒株相比发生了明显变异,在对PEDV S基因进行序列分析的基础上,本论文首先表达了PEDV中国变异株CH-ZMDZY-11与疫苗株CV777的SA区域,表达的SA蛋白具有良好的反应原性,为建立检测抗PEDV抗体的间接ELISA方法、分析PEDV流行株与疫苗株S蛋白免疫反应性差异,以及PED亚单位疫苗研究奠定了基础。以纯化的PEDV中国变异株S蛋白为包被抗原,建立了检测PEDV流行株抗体的间接ELISA方法。建立的间接ELISA方法最佳反应条件为:抗原最适包被量为1ug/孔,包被时间为37℃包被1h后4℃过夜;血清工作浓度为1:100,作用时间为1.5h;二抗选用HRP标记的兔抗猪IgG稀释度为1:4000,作用时间为1.5h;显色液TMB作用时间为15min;判定标准为,样品S/P值大于等于0.058判定为阳性,小于0.045判定为阴性。所建ELISA方法具有良好特异性和重复性。对50份疑似猪流行性腹泻血清样品进行检测,结果表明流行株抗体检测阳性的样品均为PEDV流行株抗原阳性。本研究所建立ELISA方法可用于PEDV流行株抗体检测和疫病监测。为分析PEDV流行株和疫苗株S基因差异对疫苗免疫效果影响,本研究将在表达的PEDV变异株CH/ZMDZY/11与疫苗株CV777 SA蛋白免疫小鼠与成年兔子获得多克隆抗体,并以SA蛋白为抗原,通过Western bloting及间接ELISA的方法检测两种蛋白与多克隆抗体的反应性差异,并通过兔抗PEDV SA蛋白多克隆抗体与CV777中和情况比较抗S蛋白抗体中和活性的差异。结果表明,抗PEDV疫苗株SA蛋白(YSA)多抗与疫苗株SA蛋白的反应性明显高于其与流行株SA蛋白(LSA)的反应性;与此相反,抗PEDV流行株SA蛋白多抗与流行株SA蛋白的反应性明显高于其与疫苗株SA蛋白的反应性;抗体的中和活性比较显示,抗PEDV变异株及疫苗株SA蛋白多克隆抗体在中和PEDV疫苗毒CV777上存在很大的差异,即疫苗株的抗体中和CV777效价明显高于流行株抗体的中和效价。研究结果提示,PEDV S蛋白22aa~380aa区域存在差异性抗原表位,PEDV变异株和疫苗株S基因的差异可能是导致基于CV777疫苗株的PED疫苗免疫效果不好的原因。本研究将为开发针对PEDV变异株的PED亚单位疫苗,有效控制由变异株导致的PED奠定基础。