研究背景和目的腺病毒(Adenovirus)具有宿主广泛、繁殖滴度高、不整合,对静止细胞也能感染及相对完全等特点,因而被广泛用于肿瘤基因治疗。但是,人群中普遍存在腺病毒中和抗体,不利于病毒载体的重复给药,制约了它在临床上的应用。此外,腺病毒对肿瘤的靶向性不足,使得感染肿瘤细胞的病毒量大大减少,减弱了杀伤肿瘤细胞的作用,增加了可能的机体毒副作用。因此,如何降低腺病毒载体的免疫原性,提高其肿瘤靶向性,成为基于腺病毒载体的肿瘤基因治疗亟需解决的问题。当前,降低腺病毒载体免疫原性的策略主要有以下两个方面：改造腺病毒载体和免疫调控。但目前这两种方法均系抗腺病毒免疫的优化方案,未能屏蔽腺病毒免疫原性,因而免疫系统仍然对腺病毒进行免疫识别与免疫清除。以腺病毒载体外壳蛋白修饰和基因复制与表达调控为主的增强腺病毒肿瘤靶向性的策略虽然取得了进展,但无法同时解决腺病毒的免疫原性的问题。因此如何将这些改造策略有机地结合起来,以便实现多种策略协同作用,最大限度的发挥腺病毒载体作用的同时,保证它在临床应用中的安全性,将是未来研究的重点。pHPMA是在肿瘤、骨骼及炎症等研究领域最受关注的高分子给药系统,具有生物相容性、非免疫原性、无毒性的特点,与药物接合后可以延长药物血液循环半衰期及实体瘤趋向性给药,目前通过应用pHPMA给药系统,以阿霉素为代表的多个药物已用于临床研究。近年来,Fisher等首先发现腺病毒通过pHPMA进行给药时发生免疫逃逸,证实了pHPMA可消除机体免疫系统对腺病毒的免疫识别与免疫攻击。Vladimir等在其后的研究发现pHPMA-腺病毒接合物可选择性沉积于肿瘤组织,证明了pHPMA-腺病毒接合物肿瘤靶向性给药的特点。因而,pHPMA被认为是腺病毒治疗的最佳给药系统,对提高腺病毒肿瘤靶向性,降低其免疫原性及毒副作用具有重要意义。pHPMA给药系统细胞吸收的主要障碍是细胞膜屏障,仅能通过胞吞或胞饮分布于质膜和溶酶体,难以在胞浆和胞核发挥作用,药物分子的治疗效果因而下降。目前研究的方向是开发靶向性活性分子修饰pHPMA载体的腺病毒给药系统,使pHPMA给药系统突破细胞膜屏障进入细胞浆或细胞核,提高药物的治疗效果。pHPMA的靶向分子修饰是利用靶向活性分子改变pHPMA作为大分子吸收慢而导致的腺病毒在体内活性降低的问题,使pHPMA的被动吸收变为主动运输,提高药物的内吞速度,实现药物的可控释放。目前常用的靶向分子如配体和单抗等存在与受体作用时间长的问题,导致腺病毒在体内的循环时间延长。现在通常将穿膜作用最强的穿膜肽作为活性分子以改变pHPMA一腺病毒给药系统的跨膜转运问题。但细胞穿膜肽缺乏靶向性,如能改造细胞穿膜肽的嗜性,使之在肿瘤组织进行可控释放,则可在加速pHPMA-腺病毒给药系统跨膜转运的同时,实现肿瘤的靶向性治疗,使腺病毒达到最大程度的抗肿瘤治疗效应。但用肿瘤靶向性细胞穿膜肽修饰pHPMA-腺病毒给药系统的研究尚未见相关报道。本研究拟设计合成肿瘤靶向性细胞穿膜肽对pHPMA-腺病毒给药系统进行修饰,以期在增强穿膜效率的同时,进一步增强其主动靶向性,提高腺病毒生物治疗效应。通过基因克隆技术,我们构建了广谱抗肿瘤腺病毒Ad. mda-7.egfp,通过化学合成的方法分别设计合成了高分子载体pHPMA及肿瘤靶向分子：可活化细胞穿膜肽(activatable cell-penetrating peptide, ACPPs),通过化学修饰的方法合成了ACPPs-pHPMA-Ad给药系统,对该系统的给药特点进行了分析与鉴定。成功构建的ACPPs-pHPMA-Ad. mda-7.egfp给药系统,不仅实现了腺病毒的免疫逃逸,同时加速了pHPMA-Ad. mda-7.egfp在靶细胞摄取,提高了pHPMA-Ad.mda-7.egfp肿瘤靶向性。因ACPPs的肿瘤靶向性设计是基于多种肿瘤细胞过表达基质金属蛋白酶的特性,故ACPPs-pHPMA-Ad. mda-7. egfp给药系统有望应用于多种肿瘤的临床分子诊断与治疗。方法1.抗肿瘤腺病毒Ad. mda-7.egfp的构建与鉴定选择靶向性诱导肿瘤细胞凋亡的广谱抗肿瘤基因黑色素瘤分化相关基因7(melanoma differentiation associated gene-7, mda-7),利用RT-PCR扩增mda-7基因cDNA全长,通过基因载体克隆技术构建腺病毒Ad. mda-7. egfp,应用酶切、PCR、测序及观察细胞病理现象等方法进行鉴定。2.抗肿瘤腺病毒Ad. mda-7.egfp的生物活性鉴定将Ad. mda-7.egfp感染肺腺癌细胞A549后,通过绿色荧光蛋白表达检测鉴定mda-7基因表达；通过免疫组织化学方法鉴定mda-7蛋白表达及部位,通过荧光素Hoechst33342及PI双染法,在荧光显微镜下观察凋亡细胞,鉴定腺病毒Ad. mda-7.egfp诱导肿瘤细胞凋亡的活性；通过流式细胞仪检测DMEM、Ad.egfp及Ad.mda-7.egfp诱导的支气管上皮细胞HBE及肺腺癌细胞A549细胞凋亡率,鉴定Ad. mda-7.egfp选择性杀伤作用。3.靶向分子—可活化细胞穿膜肽的合成及鉴定以聚精氨酸RRRRRRRRN为阳离子肽段,并以具有伯氨基的氨基酸天冬酰胺为其3端,以EEEEEEEEE为阴离子肽段,以PLGLAG为MMPs的酶切位点合成肿瘤靶向性的可活化细胞穿膜肽EEEEEEEEE-PLGLAG-RRRRRRRRN,通过高效液相色谱仪测定其分子量及纯度；通过与表达MMPs的肺腺癌A549细胞、子宫颈癌GLC-82细胞、卵巢癌OVCAR3细胞、乳腺癌MCF-7细胞、肺腺癌SPCA1细胞和肝癌HepG2细胞孵育,荧光显微镜观察FITC鉴定可活化细胞穿膜肽的穿膜活性。4.靶向分子—可活化细胞穿膜肽的生物活性鉴定将可活化细胞穿膜肽与HBE、肺腺癌细胞A549、SW480细胞、OVCAR3细胞孵育,以荧光显微镜观察FITC及DAPI荧光,通过两种荧光图像重叠鉴定可活化细胞穿膜肽在细胞内的定位；通过流式细胞术检测FITC荧光的变化,观察温度及时间对可活化细胞穿膜肽穿膜作用的影响；通过MTT法检测|ACPPs对细胞的毒性作用；通过全波长酶标仪检测实验组与对照组A549细胞内FITC荧光量鉴定可活化细胞穿膜肽的肿瘤靶向性穿膜活性。5. ACPPs-pc-Ad. mda-7.egfp给药系统的合成及鉴定取pHPMA-ONp溶于25μl双蒸水中形成终浓度为10mg/ml溶液；加入含有Ad.mda-7.egfp (1010vp)的10%甘油/PBS溶液100μl,4℃反应12h形成最终的接合物ACPPs-pc-Ad. mda-7.egfp,以pc-Ad. mda-7.egfp及Ad. mda-7.egfp为对照组,以动态光散射法测量ACPPs-pc-Ad. mda-7.egfp的粒径鉴定ACPPs对pc-Ad. mda-7.egfp的修饰；将产物与肺腺癌细胞A549孵育24h,以荧光显微镜及全波长酶标仪观察egfp表达,鉴定ACPPs-pc-Ad. mda-7.egfp细胞感染能力；PI标记ACPPs-pc-Ad. mda-7.egfp后与肺腺癌细胞A549孵育12h,流式细胞仪检测PI荧光,鉴定ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp细胞感染能力。6. ACPPs-pc-Ad. mda-7.egfp给药系统的免疫逃逸能力的鉴定含人抗腺病毒抗体(NAb)血清以1：20稀释于PBS液中后,分别与Ad.mda-7. egfp及ACPPs-pc-Ad.mda-7. egfp进行孵育,将孵育前后的Ad.mda-7.egfp及ACPPs-pc-Ad.mda-7感染A549细胞48h,以全波长酶标仪于波长λex488nm与λem538nm检测四组egfp荧光表达,通过分析孵育前后ACPPs-pc-Ad.mda-7. egfp感染细胞后egfp荧光的变化,鉴定ACPPs-pc-Ad. mda-7.egfp给药系统的免疫逃逸能力。7. ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp给药系统肿瘤靶向性鉴定以104Vp/孔接种96孔板以104vp/细胞将ACPPs-pc-Ad.mda-7. egfp感染HBE、A549、SW480细胞、OVCAR3四种细胞株48h,吸弃上清,PBS冲洗三次,以100μl Triton X-100裂解细胞,全波长酶标仪检测绿色荧光蛋白表达,通过分析MMPs(?)表达细胞HBE及MMPs过表达细胞A549、SW480细胞、OVCAR3细胞内荧光表达的差异,鉴定ACPPs-pc-Ad.mda-7. egfp对过表达MMPs肿瘤细胞的靶向感染能力。8. ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp给药系统的跨膜转运方式鉴定以染料Hoechst33342对细胞染色30min,以染料PI对腺病毒进行标记15min,将pc-Ad.mda-7.egfp组及ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp组(104vp/细胞)感染A549细胞4h,倒置荧光显微镜下观察Hoechst33342荧光及PI荧光,通过对比两组A549细胞内PI荧光的差异,鉴定ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp给药系统的亚细胞分布；以(FITC) ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp (PI)感染A549细胞4h,倒置荧光显微镜下观察FITC荧光及PI荧光,通过两个荧光图像重叠鉴定ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp给药系统的跨膜转运方式；以染料PI对腺病毒进行标记15min,将pc-Ad.mda-7.egfp组及ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp组(104Vp/细胞)感染A549细胞,分别于20mim、2h、4h倒置荧光显微镜下观察PI荧光,通过对比两组细胞内PI荧光的差异,鉴定Ad.mda-7.egfp细胞内吞数量。9. ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp靶向诱导A549细胞凋亡检测在6孔板中接种肺癌细胞株A549,生长至40%满后,分成3组,对照组1和对照组2分别加入无血清1640, pc-Ad.mda-7.egfp (104vp/cell),实验组加入ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp (104vp/cell)处理4h,弃上清,以PBS液洗三次后加入培养液继续培养48h,反复PBS洗涤后加入终浓度5ug/ml的Hoechst33342,避光染色10分钟后加入终浓度为15ug/ml PI,避光染色10分钟后,Heochst33342用氪激光激发的紫外线荧光,PI用氩离子激光激发荧光,结果判断：正常细胞为低蓝光／低红光,凋亡细胞为高蓝光／低红光,坏死细胞为低蓝光／高红光。10.统计学分析实验数据采用SPSS13.0软件包进行统计：细胞内FITC荧光的比较采用析因设计的方差分析及单因素方差分析；细胞内gfp荧光及PI荧光的比较采用单因素方差分析；MTT结晶的比较采用单因素方差分析。结果1.成功构建了Ad.mda-7.egfp腺病毒表达载体RT-PCR扩增mda-7基因cDNA全长,通过基因克隆技术构建了Ad.mda-7.egfp腺病毒,经过酶切、PCR、测序证明mda-7基因序列正确无误,通过HindⅢ及BglⅡ两个酶切位点与腺病毒基因组进行了基因重组。Ad.mda-7.egfp感染HEK293细胞后,引起细胞出现细胞变大、变圆、漂浮,呈葡萄串聚集等现象。2. Ad. mda-7.egfp选择性诱导肿瘤细胞的凋亡通过Ad.mda-7.egfp感染A549细胞24h可观察到绿色荧光蛋白表达；免疫组化方法检测到Ad.mda-7.egfp感染的A549细胞胞浆染色呈阳性,而Ad. Egfp组A549细胞胞浆染色呈阴性,证明了mda-7蛋白的表达。Hoechst-PI染色检测证明Ad.mda-7.egfp感染A549细胞24h可见大量高蓝色荧光及低红色荧光,为凋亡细胞荧光特征。流式细胞仪检测空白对照组、Ad. egfp及Ad.mda-7.egfp诱导HBE及A549细胞凋亡率,经单因素方差分析结果显示细胞凋亡率在A549细胞及HBE细胞组间有显著性差异(F=3627.597,P=0.000),空白对照组、Ad.egfp组、Ad.mda-7.egfp组三组间细胞凋亡率有显著性差异(F=4171.358,P=0.000),说明Ad.mda-7.egfp能够选择性诱导A549细胞凋亡。3.靶向分子—可活化细胞穿膜肽具有细胞膜穿膜活性合成可活化细胞穿膜肽EEEEEEEEE-PLGLAG-RRRRRRRRN,通过高效液相色谱仪测定分子量为2923.18,分子式为C116H200N48O41,纯度为99%以上。用FITC标记后的可活化细胞穿膜肽分别与肺腺癌A549细胞、SW480细胞、卵巢癌OVCAR3细胞共孵育,细胞经过洗涤固定后用荧光显微镜观察。荧光分子FITC标记的ACPPs孵育后,三种肿瘤细胞的内部均有较强的绿色荧光反应,证明了可活化细胞穿膜肽的穿膜活性。4.靶向分子—可活化细胞穿膜肽具有肿瘤靶向性穿膜活性流式细胞仪的荧光实验结果显示可活化细胞穿膜肽可以穿透细胞膜进入细胞内部,经析因设计的方差分析,可活化细胞穿膜肽组细胞内FITC荧光量与对照组牛血清白蛋白组相比有显著性差异(P<0.05)；全波长酶标仪检测细胞内的荧光强度显示可活化细胞穿膜肽在A549细胞内的荧光量显著高于正常细胞HBE,经析因设计的方差分析,A549细胞内荧光强度与HBE细胞内荧光强度有显著性差异(P<0.05)；细胞增殖实验证明可活化细胞穿膜肽对肿瘤细胞无明显毒性,经单因素方差分析,不同浓度的可活化细胞穿膜肽对A549细胞的毒性与对照组相比无显著差异(P>0.05)。5.成功合成了ACPPs-pc-Ad. mda-7.egfp给药系统合成了ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp接合物及pc-Ad.mda-7.egfp接合物,经动态光散射法检测,Ad.mda-7.egfp, pc-Ad.mda-7.egfp, ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp的粒径分别为141.8nn、189.4nm和236.4nm,证明腺病毒分别被pHPMA、 ACPPs-pHPMA修饰,粒径逐渐增加。荧光显微镜观察可见pc-Ad.mda-7.egfp接合物组A549细胞内仅见微量绿色荧光蛋白表达,ACPPs-pc-Ad.mda-7. egfp、 Ad.mda-7.egfp组所有细胞均可见强烈绿色荧光蛋白表达,经全波长酶标仪检测,pc-Ad.mda-7.egfp接合物相对荧光单位(RFU)为6.6%,Ad.mda-7.egfp、 ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp组RFU分别为95.9%和85.6%。经单因素方差分析,各组间RFU有显著性差异(F=894.014, P=0.000), ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp组RFU与Ad.mda-7.egfp组相比无显著性差异(P=0.161),与pc-Ad.mda-7.egfp组RFU有显著性差异(P=0.003),说明ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp具有较强感染细胞的能力。流式细胞仪分析细胞内PI荧光显示：pc-Ad.mda-7.egfp组A549细胞内PI荧光低,Ad.mda-7. egfp及ACPPs-pc-Ad.mda-7. egfp均有较强荧光,证实ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp具有较强感染A549细胞能力,pc-Ad.mda-7.egfp感染A549细胞能力弱。6. ACPPs-pc-Ad. mda-7.egfp给药系统具有显著的免疫逃逸能力将人抗腺病毒抗体(NAb)孵育前后的Ad.mda-7.egfp及ACPPs-pc-Ad.mda-7egfp感染A549细胞48h,以全波长酶标仪检测A549细胞内egfp荧光,分别为：孵育前Ad.mda-7.egfp组95.6%、ACPPs-pc-Ad.mda-7egfp组87.6%,孵育后Ad.mda-7.egfp组17.5%、ACPPs-pc-Ad.mda-7egfp组75.6%,孵育后Ad.mda-7.egfp及ACPPs-pc-Ad.mda-7egfp两组感染率皆有下降,但Ad.mda-7.egfp组显著下降,降幅达81.7%,而ACPPs-pc-Ad.mda-7egfp组仅下降13.7%。经单因素方差分析结果显示：人NAb血清孵育前后细胞内egfp荧光量有显著性差异(F=248.832,P=0.000),其中Ad.mda-7.egfp组与人NAb血清孵育前后细胞内egfp荧光量有显著性差异(F=683.132, P=0.000), ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp组与人NAb血清孵育前后细胞内egfp荧光量无显著性差异(F=7.324,P=0.054),说明人NAb血清对Ad.mda-7.egfp有明显清除作用,而对ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp则无明显清除作用,ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp具有免疫逃逸作用。7. ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp给药系统靶向感染过表达MMPs的肿瘤细胞以104vp/细胞将ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp感染HBE、A549、SW480、OVC AR3细胞四种细胞株48h,全波长酶标仪检测各组相对荧光单位(RFU)分别为：HBE(10.1)、A549(85.2)、SW480(86.2)、OVCAR3(95.6)。经单因素方差分析,三组肿瘤细胞RFU与HBE组RFU有显著性差异(P=239.827,F=0.000),说明ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp感染具有肿瘤靶向性,其靶向感染能力与肿瘤细胞的MMP2/9表达呈正向关系。8. ACPPs介导了ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp给药系统的非内吞跨膜转运以104vp/细胞将ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp(PI)感染Hoechst33342染色的A549细胞4h,倒置荧光显微镜下观察可见：两组细胞胞浆均可见均匀蓝色荧光(Hoechst33342荧光),但pc-Ad. mda-7.egfp组细胞胞浆内较少红色荧光(PI荧光),而ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp组细胞胞浆内可见大量红色荧光(PI荧光),证实了ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp的跨膜转运为非内吞方式。以104vp/细胞将(FITC) ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp(PI)感染A549细胞4h,倒置荧光显微镜下观察可见：细胞胞浆内同时见大量FITC荧光分布及PI荧光分布,说明ACPPs及Ad.mda-7.egfp分布于细胞胞浆,将荧光分步图像叠加,显示两种荧光分布于相同区域。证实了ACPPs介导pc-Ad.mda-7. egfp(PI)的跨膜转运。以染料PI对腺病毒进行标记15min,将pc-Ad.mda-7.egfp组及ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp组(104vp/细胞)感染A549细胞,于20mim、2h、4h倒置荧光显微镜下观察PI荧光,可见ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp组细胞内有较强PI荧光,且荧光于20mim、2h、4h逐渐增强,pc-Ad.mda-7.egfp组细胞PI荧光较少,荧光于20mim、2h、4h均较弱。相比pc-Ad.mda-7.egfp组,ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp组细胞内PI荧光有时间依赖性。9. ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp可诱导A549细胞凋亡培养液1640、pc-Ad.mda-7.egfp和ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp分别与A549细胞孵育4h,培养48h后以Hoechst33342、PI双染法观察细胞内荧光可见：空白对照组和pc-Ad.mda-7.egfp组细胞可见弥散均匀的低蓝色荧光,少见红色荧光,ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp组于荧光显微镜下观察到高蓝色荧光及低红色荧光,提示空白对照组和pc-Ad.mda-7.egfp组细胞凋亡数目均较少,ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp组细胞凋亡数目增多,说明ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp具有更高的诱导A549细胞凋亡的效应。结论1.成功构建了重组腺病毒载体Ad.mda-7.egfp,该载体能介导mda-7/IL-24基因在人肺癌细胞A549和正常支气管上皮细胞中表达。2. Ad.mda-7.egfp能选择性诱导A549细胞凋亡,是高效的抗肿瘤腺病毒载体。3.成功设计合成了可活化细胞穿膜肽,经流式细胞仪检测其具有明显的穿膜活性和肿瘤靶向性,对细胞无明显毒性,对细胞生长亦无明显影响。4.成功合成了ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp接合物,并能有效感染细胞。5. ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp能逃避抗腺病毒抗体的中和作用,并具有肿瘤靶向性,在过表达MMP2/9的肿瘤细胞其跨膜转运能力显著高于正常细胞。6. ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp跨膜转运系ACPPs介导的非胞吞途径跨膜转运,药物转运速度快,分布于细胞胞浆。7. ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp能有效诱导肺癌A549细胞发生凋亡,可作为肿瘤基因治疗的载体。ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp可逃避免疫清除,提高腺病毒肿瘤靶向性,适用于众多实体肿瘤而无明显副作用,有望成为抗肿瘤基因治疗的理想给药方式。