随着工业污染的加剧和生活方式的改变,环境中可导致免疫性肝损伤和肠损伤的外源因子逐年增多:乙肝病毒、工业毒物、药物和乙醇等都可以造成不同程度的免疫性肝损伤;重金属、甲醛和食物抗原均可以引起不同程度的肠道炎症反应。同时,免疫性肝损伤和肠损伤伴有遗传倾向。因此,近年来与免疫性肝肠损伤相关的外源化学物-基因-环境的相互作用受到了科研界的高度重视。本课题组前期研究发现,i PLA₂β敲除老龄小鼠患肝癌及肠损伤的机率远远高于正常老龄鼠。由于炎症是外源化学物诱导肝脏损伤的重要毒理学条件,本研究推测i PLA₂β缺失导致慢性炎症,慢性炎症可能导致年龄依赖的严重肝脏损伤甚至肝癌。然而,i PLA₂β在外源化学物诱导的免疫性肝损伤和肠损伤中的作用尚不明确。若具有保护作用,具体机制是什么?这些都是目前亟待回答的问题。因此,本研究采用i PLA₂?缺失小鼠作为实验对象,Con A和DSS作为诱导免疫性肝损伤和肠损伤的实验模型,对i PLA₂β在肝肠损伤中的作用及相关机制进行了系统性的探讨,以期为其损伤机理提供理论依据,为有效的预防和治疗方案寻求新的思路。1.i PLA₂β在Con A诱导的免疫性肝损伤中的保护作用研究采用i PLA₂β-/-小鼠和野生型小鼠作为研究对象,采用10 mg/kg的Con A尾静脉注射24 h后,处死并取肝脏组织进行病理学检测。HE染色发现染毒组的i PLA₂β-/-小鼠的肝细胞出现大面积的坏死;免疫组织化学染色发现Con A染毒后i PLA₂β-/-小鼠出现了更严重的CD3（+）T细胞和CD45R（+）B细胞浸润,本研究采用Ki67作为细胞增殖的标记进行免疫组织化学分析,染毒组的i PLA₂β-/-小鼠肝脏出现大量的淋巴细胞扩增,表现出更严重的肝脏炎症反应。通过苦味酸-天狼星红染色法和α-SMA免疫组织化学染色发现i PLA₂β敲除加剧了Con A诱导的纤维化。同时,通过胆管上皮细胞标记CK19的免疫组织化学分析发现,i PLA₂β敲除加剧了Con A诱导的的胆管扩张。以上结果表明i PLA₂β在Con A诱导的免疫性肝损伤中具有保护作用。2.i PLA₂β在Con A诱导的肠损伤中的保护作用本研究以Con A染毒小鼠的小肠组织为研究对象,HE染色发现i PLA₂β-/-小鼠十二指肠黏膜层损伤严重;免疫组织化学染色和Western Blot蛋白定量发现回肠Cleaved caspase 3（+）凋亡相关蛋白表达增加;十二指肠Ki67（+）隐窝处表达增加。采用实时定量PCR技术对炎症因子的表达量进行分析发现,i PLA₂β缺失导致Con A诱导的小肠炎症反应的增加,固有免疫反应细胞因子CD14、TNF-α、IL-6、SOCS3和趋化因子CCR5、CXCL12、VCAM1的m RNA表达水平显著高于野生组。i PLA₂β-/-小鼠空肠总CCL2在蛋白以及m RNA表达水平上均显著升高。AB-PAS染色法观察小肠黏液层的完整性。Con A染毒后,i PLA₂β-/-小鼠十二指肠的杯状细胞数量和黏液分泌显著增加。两个调控杯状细胞分化和增殖的关键基因Klf4和Ccnd2的表达在两个处理组中也有显著差异。小肠杯状细胞功能的缺失以及黏液层的破坏导致肠腔内的细菌直接进入小肠进而分泌入血。i PLA₂β-/-小鼠门静脉中的内毒素水平显著上升证实了这一结论。综上所述,i PLA₂β在Con A诱导的肠损伤中具有保护作用。3.i PLA₂β对Con A诱导的胆汁酸代谢稳态的保护作用采用LC/MS-MS的检测手段分析肝脏、小肠、胆汁、粪便以及下腔静脉血液中的胆汁酸谱。i PLA₂β-/-导致各组织对Con A的胆汁酸响应改变:与野生型对照组相比较,胆汁酸响应水平在肝脏中净减少1303μg/g、胆汁中净减少689μg/m L、小肠中净增加48μg/g、粪便内净增加6.6μg/g以及下腔静脉血液中净增加20μg/m L。用实时定量PCR检测胆汁酸相关转运子的m RNA水平的表达量发现,Con A染毒后i PLA₂β缺失导致肝脏内胆汁酸合成基因CYP7A1的表达水平显著下调,与小肠内负反馈调节FXR/FGF15生物轴的表达上调相一致;肝脏内胆汁酸转运蛋白NTCP、BSEP和小肠内胆汁酸转运蛋白OSTβ、ABST均表达下调。结果表明,i PLA₂β可通过调节胆汁酸的合成及转运维持免疫性肝损伤过程中胆汁酸的代谢稳态,避免肝脏及小肠组织被进一步损伤。4.i PLA₂β在DSS诱导的肠损伤中的保护作用基于在免疫性肝损伤过程中i PLA₂β对小肠具有的保护作用,为了进一步证实该酶对于免疫性肠损伤的特异性保护功能,本研究进行了急性结肠炎的诱导。对于急性结肠炎的诱导,小鼠自由饮用含有2.5%或3%的DSS水溶液,连续引用7天后再饮用正常水3天。组织学分析发现i PLA₂β缺失加剧了结肠病理损伤,免疫组织化学染色证实该损伤与上升的Cleaved caspase 3（+）上皮细胞凋亡和隐窝处Ki67（+）增殖损伤相关。AB-FA染色法观察发现DSS染毒后i PLA₂β-/-小鼠杯状细胞数量下降以及黏液内层的完整性缺失,只有极少量的黏液分泌。免疫组织化学染色结果显示,DSS染毒的敲除小鼠结肠固有层中F4/80（+）巨噬细胞数量显著高于对照组,与实时定量PCR对F4/80 m RNA表达量的检测结果相一致。染毒组的树突细胞标记CD11b和CD11c的m RNA表达量显著高于对照组。i PLA₂β缺失导致DSS诱导后细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和趋化因子MIP-1α、MIP-1β以及MCP1的表达量升高。i PLA₂β缺失导致DSS诱导后回肠出现严重损伤,伴随有黏膜层结构破坏,小肠绒毛的钝化,固有层暴露以及小肠绒毛缩短。同时,AB-FA染色发现,回肠杯状细胞数量的显著下降。Cleaved caspase 3免疫组织化学染色发现,回肠凋亡细胞增加,且大部分凋亡细胞位于隐窝底部。综上所述,i PLA₂β在DSS诱导的免疫性肠损伤中具有保护作用。