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研究背景乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)血源性感染是一个全球范围内的健康问题,可造成慢性感染和慢性肝病,患者死于肝硬化和肝癌的风险很高。α干扰素(interferon α,IFNa)是临床治疗慢性乙型肝炎的最常用的药物,可以显著抑制HBV复制。研究证实α干扰素结合细胞表面受体,通过一系列信号转导通路,激活下游抗病毒蛋白,包括RNA特异性腺苷脱氨酶(adenosine deaminases acting on RNA, ADAR1)、粘病毒抵抗蛋白A GTP酶(myxovirus-resistant GTPase, MxA)等实现抗病毒作用。关联研究发现ADAR1基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位点与IFN治疗多发性硬化及慢性丙型肝炎疗效相关,本实验室前期研究也表明,ADAR1 rs4845384可能是IFN α治疗慢性乙型肝炎无应答的相关因素,与乙肝病毒e抗原(hepatitis B e antigen,HBeAg)血清转换和自发性及干扰素诱导的乙肝病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)清除相关。ADAR1主要生物学功能是作为RNA编辑酶催化其底物dsRNA发生A-to-I的脱氨反应,转录时I被读为G,而发生核苷替换：还可利用独立于编辑活性的RNA结合蛋白的功能发挥作用。研究表明,RNA编辑酶在肿瘤发生发展过程中发挥重要功能,ADAR1的表达受到机体内源的调节因子miRNAs的调控,从而引起肿瘤的恶性化发展；另外,亦有研究发现其在不同种类的病毒感染中表现出促进病毒感染或抵抗病毒感染的作用。近年来有研究发现在丙型肝炎病毒感染时,ADAR1能抑制丙型肝炎病毒复制影响其活性,具有潜在的抗病毒机制。目前其在慢性乙肝中的作用报道很少,其作用和机制都存在争议。本研究在前期研究的基础上,进一步探索ADAR1在HBV感染中的作用机制,为研究乙肝病毒的感染致病机制及治疗乙肝提供新的基于ADAR1的靶点和策略。研究方法在HeLa、SK-HEP-1、QGY-7703、HepG2、HepG2.2.15、Hep3B和SMMC-7721等7个细胞系中通过双荧光素酶报告基因实验揭示ADAR1 rs4845384多态性位点对报告基因活性的影响：构建ADAR1过表达质粒和shRNA发夹质粒,瞬时转染HBV阳性细胞系HepG2.2.15以上调或下调ADAR1基因表达水平,ELISA和实时荧光定量PCR方法检测上清中HBV标志物水平,验证ADAR1在HBV感染中是否发挥作用;构建ADAR1基因3’-UTR荧光素酶报告基因质粒,用microRNA.org-Targets and Expression TargetScan、miRTarBase等网站预测与ADAR1基因相互作用的miRNAs并合成相关microRNA表达质粒,双荧光素酶报告基因实验筛选与ADAR1基因3’-UTR相互作用的miRNA以探讨ADAR1基因在HBV感染中发挥作用的可能机制。研究结果1. ADAR1 rs4845384对报告基因活性的影响应用pGL3-rs4845384A和]pGL3-rs4845384G表达质粒,瞬时转染HepG2.2.15、 HepG2等6个肝癌细胞系和HeLa非肝癌细胞系,双荧光素酶报告基因实验结果表明,pGL3-rs4845384(表达活性显著高于pGL3-rs4845384A(P<0.05),尤其在HBV阳性细胞HepG2.2.15中。IFNα诱导处理后,报告基因活性均显著升高。2. ADAR1与HBV感染相关的体外功能研究1)质粒构建成功构建了ADAR1两种构型(p110,p150)的过表达质粒,以及筛选能够特异结合并干扰ADAR1表达的shRNA,构建发夹质粒sh-ADAR1。瞬时转染HepG2.2.15等细胞系,过表达及干扰效果良好。2) HepG2.2.15上清HBV感染标志物的检测瞬时转染相关质粒72h后,ELISA实验发现过表达ADAR1(p110/pl50)后HBsAg和HBeAg均显著上升(P<0.05),干扰后均显著下降(P<0.05)；提取上清HBV DNA,实时荧光定量PCR的研究结果表明,上调ADARl表达后HBV DNA拷贝数显著上升(P<0.05),下调其表达则HBV DNA拷贝数显著减少(P<0.05)。3.与ADAR1 3’-UTR相互作用的microRNA初步筛选验证初步筛选出与ADAR1基因3’UTR相互作用的7个miRNAs:hsa-miR-93, hsa-miR-143,hsa-miR-20b,hsa-miR-20a,hsa-miR-613,hsa-miR-106a,hsa-miR-206。研究结论1.SNP功能实验提示,rs4845384 G等位基因报告基因活性较高,rs4845384可能通过调节ADAR1表达水平影响IFNα治疗CHB的疗效。2.过表达及干扰ADAR1表达后HepG2.2.15上清中HBV标志物水平显著升高及降低,ADAR1基因可能促进HBV病毒的复制和分泌。3.初步筛选发现hsa-miR-93, hsa-miR-143,hsa-miR-20b,hsa-miR-20a,hsa-miR-613, hsa-miR-106a,hsa-miR-206等7个miRNAs可能与ADAR1基因3’-UTR存在相互作用。