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茅苍术(Atractylodes lancea(Thunb.)DC.)为菊科多年生植物,以根茎入药,为我国传统常用中药材苍术。实验室前期对湖北英山茅苍术种植基地进行田间种质资源调查时,发现部分植株发生扁茎变异现象,主要表现为茎秆扁平、叶序紊乱、花序发育不良等现象,但药材产量和指标成分含量均有所提高。前期研究已确认这一扁茎变异是由于翠菊黄花组16SrI-B植原体(Candidatus Phytoplasma asteris)侵染导致,并通过转录组学手段初步研究了扁茎发生的机制。本研究在上述研究基础上,从代谢组学入手研究扁茎茅苍术代谢改变,并进一步从分子水平上对茅苍术萜类化合物前体生物合成的MEP途径关键酶,以及萜类合成酶进行基因克隆和表达分析,旨在通过扁茎与正常茅苍术间的代谢差异阐明二者间的药材品质差异,并进一步研究萜类化合物生物合成的分子机制。本研究将为阐明植原体侵染后茅苍术植株的代谢响应机制及茅苍术有效成分的代谢调控及药材品质的提高提供科学依据。主要研究内容如下:1.扁茎茅苍术的代谢组学研究以扁茎及正常茅苍术的叶及根茎为材料,利用基于GC-MS的非靶标代谢组学方法,研究了扁茎及正常茅苍术的代谢轮廓,采用NIST库及部分对照品对代谢物组成进行定性鉴别,结合PCA、OPLS-DA等模式识别方法建立了扁茎药材的判别方法,筛选了丙二醇、萘、β-谷甾醇、6-氯-3-吲哚基-D-吡喃半乳糖苷、人参环氧炔醇、吡喃甘露糖、麦芽糖、肌醇半乳糖苷、甲基半乳糖苷、D-核糖酸、D-半乳糖、塔格糖等12个化合物作为扁茎药材的潜在差异代谢物。这一结果为阐明植原体引起的代谢改变轮廓及扁茎药材的鉴定提供了基础。2.茅苍术萜类生物合成MEP途径关键酶克隆及分析首次克隆了茅苍术MEP途径的MCT基因(AlMCT)、CMK基因(AlCMK)、MDS基因(AlMDS)、HDS基因(AlHDS)、及HDR基因(AlHDR)的全长cDNA序列并进行了生物信息学分析。组织特异性表达结果显示,AlMCT、AlCMK、AlMDS、AlHDS、AlHDR基因在茅苍术的各部位均有表达,AlMCT、AlMDS、AlHDR在叶中大量表达,AlCMK、AlHDS在茎中大量表达。本部分结果对茅苍术的MEP途径进行了细致的研究,进一步了解了萜类前体合成途径中的关键基因,为后期的研究奠定基础,为茅苍术的的生物合成提供有意义的参考。3.茅苍术AlTPS1基因的克隆、分析及功能验证首先克隆得到茅苍术萜类合成酶(AlTPS1)全长序列,并进行生物信息学分析。结果显示AlTPS1的开放阅读框为1644bp,编码547个氨基酸,在系统进化树中AlTPS1与其他被子植物的TPS蛋白一起聚集在TPS-a亚支。进一步进行了AlTPS1蛋白表达及体外酶活催化实验,以FPP为底物进行体外酶活实验,产物为倍半萜类成分姜烯。以GPP为底物进行体外酶活实验,产物分别为月桂烯/芳樟醇,水芹烯,a-蒎烯,芳樟醇,香叶醇,草蒿脑。本部分研究获得了茅苍术首个萜类环化步骤的合成酶基因,为茅苍术有效成分的代谢调控及药材品质的提高提供了科学依据。综上,本研究阐明了扁茎茅苍术的代谢轮廓,找寻出了潜在的生物标志物,并进一步解析了茅苍术萜类前体生物合成MEP途径的关键基因,还首次获得了茅苍术萜类环化步骤的关键基因AlTPS1。本研究所得结果对阐明茅苍术扁茎变异的发生机制及萜类化合物生物合成机制提供了重要研究基础,为将来合理利用扁茎这一特殊现象提高药材品质,及有效成分代谢调控提供依据。