目的:头颈部恶性肿瘤发生率约14/10万,占全身恶性肿瘤的16%-40%,90%以上病理类型为鳞状细胞癌(英文全称Head and neck squamous cell carcinoma,简称HNSCC,头颈部鳞癌)。尽管近三十年来中晚期头颈部鳞癌的多学科综合治疗得到有效提高,但其总体预后仍未明显改善,患者5年生存率始终低于50%。化疗抵抗是影响中晚期头颈部鳞癌患者预后不良和复发的主要因素。因此,头颈部鳞癌仍是肿瘤领域的难治性疾病,深入探究其化疗抵抗的分子机制,进一步寻找更有效的治疗靶点是改善患者生存亟待解决的实际问题。PSMD14,26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 14,全称26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基14,属于JAMM/MPN类去泛素化酶,是组成26S蛋白酶体的盖子复合物的亚基之一。PSMD14通过其去泛素化酶功能影响底物蛋白质的泛素化降解,使细胞内蛋白质合成与降解失衡。PSMD14在许多肿瘤中表达上调且与肿瘤的预后不良有关。但是,PSMD14在头颈部鳞癌中的作用及其机制尚未明确,本研究旨在探讨PSMD14在头颈部鳞癌中的表达情况与肿瘤临床病理学特征的关系,并进一步探究PSMD14对头颈部鳞癌化疗抵抗的影响以及其作用机制,为头颈部鳞癌的临床转化治疗提供新的思路。方法:1.使用TCGA数据库分析网站GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)对人类常见肿瘤中PSMD14的表达情况进行分析,运用GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)中多个表达谱芯片分析PSMD14基因在头颈部正常上皮和头颈部鳞癌组织中的表达。并利用TCGA数据库(http://cancergenome.nih.gov/)分析PSMD14表达水平与头颈部鳞癌患者。收集天津医科大学肿瘤医院头颈外科收治的88例头颈部鳞癌组织样本,免疫组化实验检测PSMD14表达水平,并分析其与头颈鳞癌患者临床病理特征之间的关系。2.筛选头颈部鳞癌细胞系Scc15和UM1作为体外细胞实验的研究对象,利用小干扰RNA(si PSMD14)敲低头颈部鳞癌细胞PSMD14的表达,并通过蛋白免疫印迹实验和q RT-PCR实验验证敲低效果。通过MTT实验、克隆形成实验检测头颈部鳞癌细胞增殖的变化;通过流式细胞术实验检测头颈部鳞癌细胞在顺铂治疗下凋亡率的变化。其次,应用q RT-PCR实验检测敲低PSMD14后,肿瘤干性指标Oct4、Sox2和Nanog的变化;免疫荧光实验证实敲低PSMD14表达影响干性指标Sox2表达;成球实验验证不同表达水平的PSMD14对头颈部鳞癌细胞干性的影响。筛选PSMD14敲降稳定克隆细胞Scc15,建立裸鼠皮下荷瘤模型,评价PSMD14对头颈部鳞癌细胞体内生长的影响。3.慢病毒感染并筛选稳定敲降PSMD14的头颈部鳞癌细胞系Scc15和UM1,探究PSMD14在头颈部鳞癌化疗抵抗中的作用机制。通过蛋白免疫印迹实验和q RT-PCR实验检测E2F1、Sox2、Akt、p-Akt的表达变化;通过体外泛素化实验检测不同PSMD14表达水平下E2F1的泛素化水平;Ch IP实验验证PSMD14通过E2F1对下游基因Sox2转录的影响。以上实验均是为了验证我们的猜想,PSMD14可以通过调控转录因子E2F1的稳定性影响Sox2基因转录和Akt通路活性,进而增强头颈部鳞癌细胞的干细胞样特性(干性)。结果:1.使用GEPIA分析工具对人类常见肿瘤中PSMD14表达情况的分析表明,PSMD14在肿瘤组织中均异常表达,绝大多数呈现异常升高,例如头颈鳞状细胞癌及食管癌,也有异常降低,例如急性髓细胞样白血病。通过分析GEO数据库中头颈部鳞癌表达谱芯片数据(GSE13601、GSE33205和GSE37991)发现,与正常头颈部上皮组织相比,头颈部鳞癌组织中PSMD14表达水平明显升高(p<0.0001、p<0.0001和p=0.0384)。利用TCGA数据库分析不同表达水平PSMD14的头颈部鳞癌患者生存,结果显示PSMD14高表达患者的预后更差(p=0.0048)。对天津医科大学肿瘤医院头颈外科收治的88例头颈部鳞癌患者病理切片进行免疫组化染色,根据免疫组化评分结果将患者分为PSMD14高表达组和低表达组,结合患者临床病理资料进行单因素分析,结果证实PSMD14高表达与肿瘤临床分期(p=0.012)、T分期(p=0.004)和肿瘤复发(p<0.001)显著正相关,随访结果显示PSMD14高表达组生存时间更短,与TCGA数据库分析结果一致。2.小干扰RNA(si PSMD14)转染头颈部鳞癌细胞系Scc15和UM1后,蛋白免疫印迹实验和q RT-PCR实验验证PSMD14的敲除效果,结果显示PSMD14表达水平明显降低。MTT实验结果显示,相比于阴性对照组,敲低PSMD14组的增殖能力减弱;同时,PSMD14敲低组的平板克隆形成能力受到明显抑制。流式细胞术实验检测头颈部鳞癌细胞在顺铂治疗下的凋亡水平,对照组细胞凋亡率明显低于PSMD14敲低组。q RT-PCR实验结果显示敲低PSMD14组中的Sox2 m RNA水平显著降低。免疫荧光实验结果同样显示Sox2表达下调,趋势与q RT-PCR结果一致。成球实验结果表明,PSMD14敲低组的干性成球能力显著降低。体内动物实验结果显示,相比于阴性对照组,PSMD14敲低组的体内生长受到抑制,且其差异具有统计学意义。3.Scc15和UM1头颈部鳞癌细胞感染慢病毒并筛选PSMD14敲低稳定克隆。蛋白免疫印记实验结果显示,敲低PSMD14导致E2F1、p-Akt和Sox2蛋白表达受到明显抑制。加入MG132抑制蛋白酶体活性后,E2F1的受抑制程度得到缓解,这说明PSMD14抑制了E2F1的泛素化降解。体外泛素化实验结果进一步证实敲低PSMD14组较阴性对照组的E2F1泛素化水平增强。Ch IP实验结果显示,敲除PSMD14可以抑制E2F1与Sox2启动子区的结合,进而影响头颈部鳞癌细胞的细胞干性。研究证实,Akt通路的激活是顺铂耐药的特征之一,因此我们检测了PSMD14对细胞通路的影响。蛋白免疫印记实验结果显示,p-Akt表达水平随着顺铂药物时间延长逐步升高,提示PSMD14对头颈部鳞癌化疗抵抗的影响与Akt通路激活有关。结论:1.PSMD14在头颈部鳞癌中表达显著上调,与肿瘤临床分期、T分期和肿瘤复发和化疗耐药显著正相关,且预示着患者预后不良;2.在体外实验中,抑制PSMD14表达可以增加头颈部鳞癌细胞的化疗敏感性和降低头颈鳞癌的细胞干性;3.在裸鼠移植瘤模型中,敲低PSMD14可以抑制头颈鳞癌细胞的体内生长能力;4.在头颈部鳞癌中,PSMD14抑制转录因子E2F1的泛素化降解,E2F1通过转录激活和调控Akt通路双重促进Sox2表达,从而增强了肿瘤细胞干性,促进了头颈部鳞癌的化疗抵抗。