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阿尔茨海默病(Alzheimerdisease,AD)是以学习记忆障碍为主要特征并且与年龄相关的神经退行性疾病。随着全球老龄化现象的加重,阿尔茨海默病的患病人数在不断增加,造成的社会问题和经济负担日益严重,遗憾的是,AD的具体发病机制仍不清楚,因此,进一步的实验探讨和新的靶点筛选将是目前的研究方向。本实验通过铝中毒模型,确证差异表达的基因mmp9,并且利用Crispr/Cas9技术建立了 mmp9的基因敲除斑马鱼模型,联合APPsw斑马鱼痴呆模型及铝中毒,探讨mmp9基因在AD发生中的作用,为阿尔茨海默病的治疗提供新的靶点。具体研究内容和结果如下:1、mmp9基因上调在铝中毒斑马鱼模型中的验证实验室前期斑马鱼铝中毒模型的基因芯片结果显示,mmp9 mRNA转录水平升高,本实验利用野生型斑马鱼经100μg/L、pH==5.8的酸性AlC13处理40天,RT-qPCR验证脑内mmp9 mRNA转录水平上调(p<0.05)。2、mmp9基因敲除模型的建立利用CHOPCHOP网站,筛选敲除靶位点。构建pT7-mmp9-gRNA体外转录模板并进行体外转录。将体外转录的特异性gRNA(终浓度50 ng/μL)和Cas9mRNA(终浓度300ng/μL)混合后显微注射到野生型AB品系及APPsw转基因品系斑马鱼受精卵单细胞中,酶切及sanger测序验证敲除效果。筛选敲除成功的F0代斑马鱼,与野生型AB品系斑马鱼及APPsw转基因品系斑马鱼杂交,以同样的方法筛选敲除成功的F1代斑马鱼自交,最终成功获得F2代mmp9基因敲除纯合子,构建了稳定的mmp9-KO、APPsw-mmmp9-KO品系,对敲除品系斑马鱼的孵化率及表型进行观察,并对幼鱼的行为学进行检测,结果显示,F2代敲除品系纯合子斑马鱼孵化率与正常斑马鱼无异,未见畸形表型,幼鱼期移动距离与未敲除品系相比,没有显著统计学差异(P>0.05)。3、铝中毒联合APPsw斑马鱼模型探讨mmp9基因的作用将6月龄野生型AB系斑马鱼、APPsw转基因型斑马鱼及F1代APPsw-mmp9-KO斑马鱼,每个品系分成两组:循环养殖水处理组(对照组)、酸性AlCl3处理组。酸性AlCl3处理:100μg/LpH==5.8的AlCl3溶液浸泡20天。通过Noldus检测斑马鱼行为学的变化;利用HE染色、尼氏染色、免疫组化及透射电镜观察斑马鱼病理学变化;利用RT-qPCR检测基因转录水平的变化。结果显示,与正常组和APPsw组相比APPsw斑马鱼在酸性AlCl3处理之后,行为学出现异常,找到营养丰富区的潜伏时间明显延长(p<0.01);病理结果显示,端脑及皮质区的颗粒细胞减少并出现空洞,神经元数量显著减少(p<0.01),核膜边界消失,细胞器数量减少,Ap1-42在胞膜和血管的沉积增加;RT-qPCR 结果显示,claudin2、claudmpin 5b、IL-1β、ERK1、m2、mmp14均上调(p<0.01),claudin h 下调(p<0.01)。而 APPsw-mmp9-K0 酸性 AlCl3处理组与APPsw斑马鱼酸性AlCl3处理组相比,行为学结果显示,找到EC区的潜伏时间较APPsw组缩短(p<0.05);病理结果显示,颗粒细胞虽有减少,但是空洞较少,神经元数量下降减少,核膜出现皱缩,但是边界可见,A31-42的沉积减少,主要累及胞膜,累及血管较少;RT-qPCR 结果显示,claudin2、claudin 5b、IL-1β、I1mmp2、mmp14的转录水平,较APPsw斑马鱼酸性AlCl3处理组出现下调(p<0.05)。综上所述,铝暴露与APPsw之间具有协同作用,铝暴露能够加速APPsw斑马鱼AD样病理变化的进程。通过敲除APPsw斑马鱼mmp9基因,降低了铝暴露造成的机体炎症水平,减轻酸性AlCl3与APPsw之间的协同作用,减缓两者所致的阿尔茨海默病的发病进程,暗示抑制mmp9可能是防治阿尔茨海默病的一种新思路。