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研究背景:细胞衰老是一种周期停滞、表型改变和炎症因子分泌活跃的状态,能够促进多种衰老相关疾病的发生和发展。肾小管上皮细胞衰老是促进肾脏纤维化（Renal fibrosis,RF）进展的重要因素,然而其分子调控机制尚不清楚。自噬流损伤阻滞自噬小体降解,加速细胞衰老。转录因子EB（Transcription factor EB,TFEB）是调控自噬流的关键基因,在“自噬小体-溶酶体”途径的上游发挥核心作用。6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）甲基化广泛存在于各种生物学过程,最新研究表明,m6A对衰老相关疾病具有多种生物学调控作用,然而,其分子调控机制尚不清楚,也缺乏中、西药物的干预措施。孙伟教授基于“护肾延衰”理念,将肾脏衰老的病机高度概括为“肾虚湿瘀”,创立“益肾清利活血”法并应用其方药（“益肾清利活血方”）改善肾脏衰老和RF。但是,迄今为止,益肾清利活血方改善肾脏衰老和RF的相关分子机制仍不清楚。研究目的:1.阐明益肾清利活血方改善肾脏衰老和RF的作用;2.揭示益肾清利活血方通过m6A甲基化对自噬流的调控延缓肾脏衰老和RF的分子机制。研究方法:1.网络药理学研究:首先利用中药系统药理学数据库及分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP）数据库和文献检索收集益肾清利活血方成分及靶点,使用Cytoscape软件构建单味药的有效成分-靶点网络,构建益肾清利活血方的药物-成分-靶点网络;其次,在GeneCards数据库中收集RF（或CKD）相关分子靶点,利用仙桃生信分析网站筛选中药方剂与疾病的共同靶点,分析方剂与疾病共同靶点的GO/KEGG通路富集,构建蛋白互作网络并筛选关键靶点;最后,利用蛋白质结构数据库（Protein Data Bank,PDB）网站对重要活性成分和关键靶点进行分子对接验证。2.实验研究:在体研究中,采用“单侧肾切除+D-gal腹腔注射”建立肾脏衰老和RF模型,将30只大鼠随机分为4组,具体分组及干预措施如下:假手术组6只,每日给予生理盐水6ml/kg腹腔灌胃;模型组12只,每日给予D-gal 300mg/kg腹腔注射;益肾清利活血方组6只,每日给予益肾清利活血方颗粒剂混悬液2.745g/kg腹腔灌胃并联合D-gal 300mg/kg腹腔注射;维生素E（Vitamin E,VE）组6只,每日给予30mg/kg腹腔灌胃并联合D-gal 300mg/kg腹腔注射。在造模前和给药干预后,定期观察大鼠一般情况、肾功能和体重变化;此外,采用天狼星红染色观察大鼠肾脏胶原沉积水平;采用免疫组织化学或免疫荧光染色技术观察抗衰老蛋白Klotho、自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3）、自噬蛋白 Beclin1 和自噬接头蛋白（Sequestosome-1,SQSTM1）和甲基转移酶样蛋白 3（Methyltransferase-like 3,METTL3）在肾脏中的分布和丰度,衰老相关β-半乳糖苷酶（Senescence-associated β-galactosidase,SA-β-gal）染色分析衰老细胞数量,采用Western Blot（WB）检测大鼠肾脏Klotho,衰老周期蛋白 P27 和 P16,衰老相关分泌表型（Senescence-Associated Secretory Phenotype,SASP）炎性因子白细胞介素 6（Interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）和转化生长因子-β（Transforming growth factor-β,TGTF-β）,RF 标志物胶原-Ⅰ（Collagen-Ⅰ,Col-Ⅰ）和α-平滑肌肌动蛋白（α-Smoothmuscle actin,α-SMA）,甲基化转移酶 METTL14和 Wilm 肿瘤 1-相关蛋白（Wilms Tumor 1-Associated Protein,WTAP）的蛋白表达水平,采用qRT-PCR和WB观察TFEB、METTL3表达水平,采用透射电镜观察细胞内自噬小体数量,EpiQuikTM m6ARNA甲基化定量试剂盒检测大鼠肾组织内m6A总体水平;离体研究中,使用D-gal构建NRK-52E细胞衰老和RF模型,具体分组及干预措施如下:对照血清组（10%空白血清组）、模型组（D-gal 200mM）、益肾清利活血方含药血清低剂量组（D-gal 200mM+5%益肾清利活血方含药血清）、益肾清利活血方含药血清中剂量组（D-gal 200mM+10%益肾清利活血方含药血清）、VE 组（D-gal 200mM+VE 50μg/mL）。CCK-8检测D-gal、益肾清利活血方含药血清、VE对NRK-52E细胞活性的影响,SA-β-gal染色观察NRK-52E细胞衰老改变,WB实验检测NRK-52E细胞Klotho、P27、P16、IL-6、TNF-α、TGF-β、Col-Ⅰ、α-SMA、METTL14、WTAP 蛋白表达水平,qRT-PCR 和 WB 实验观察TFEB、METTL3表达水平,构建Klotho沉默细胞株、TFEB过表达细胞株、METTL3沉默细胞株,利用qRT-PCR和WB实验检测细胞构建结果;EpiQuikTM m6ARNA甲基化定量试剂盒检测细胞内m6A总体水平,m6AMeRIP试剂盒检测TFEB与m6A结合水平。结果:1.网络药理学:益肾清利活血方治疗RF是多成分、多靶点的网状调控机制。对方剂和疾病的共同靶点进行通路富集分析发现,多条细胞氧化应激相关通路、炎症和炎症因子相关通路和衰老或细胞衰老相关通路被富集到,该结果与RF的疾病特征高度一致。KEGG分析富集到的细胞衰老、磷酸肌醇-3激酶（Phosphatidylinositol-3 kinase,PI3K）蛋白激酶B（Protein kinase B,AKT）、丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）等信号通路均在RF中发挥重要作用。分子对接结果提示,益肾清利活血方的有效成分槲皮素、山奈酚和黄芩素与其靶基因TP53、AKT1可以有效结合。2.实验研究:在体研究:1)对于“单侧肾切除+D-gal腹腔注射”诱导的大鼠肾脏衰老和RF模型,益肾清利活血方和VE能够维持基础体重,降低BUN水平,减少肾组织中蓝色阳性衰老细胞数量,上调肾组织中Klotho蛋白表达,下调P27、P16、IL-6、TNF-α、TGF-β、Col-Ⅰ、α-SMA蛋白表达,抑制肾小管周围胶原沉积;2)益肾清利活血方能够修复“单侧肾切除+D-gal腹腔注射”诱导的大鼠肾组织自噬流损伤,使LC3 Ⅱ、Beclin1、磷酸化SQSTM1蛋白表达恢复到基础水平;3)益肾清利活血方通过抑制METTL3活性,减少TFEB mRNA上m6A甲基化修饰水平,在转录和蛋白水平增加TFEB表达,改善自噬流水平,从而发挥延缓衰老抗RF的作用。离体研究:1)D-gal诱导NRK-52E细胞发生衰老和RF改变,以200mM干预24h最为显著;2)益肾清利活血方含药血清和VE能够上调Klotho蛋白表达,降低P27、P16、Col-Ⅰ和α-SMA蛋白表达,抑制SASP因子释放,减少SA-β-gal的阳性染色率,其中益肾清利活血方含药血清以10%浓度干预24h最为显著,VE以50μg/mL剂量干预24h最为显著;3)敲减Klotho蛋白的NRK-52E细胞中,Col-Ⅰ和TGF-β蛋白表达水平升高,经益肾清利活血方含药血清干预后并未发生明显改变;4)益肾清利活血方含药血清和VE能够修复D-gal诱导的自噬流损伤,加速LC3 Ⅱ、Beclin1、p-SQSTM1蛋白的降解;5)益肾清利活血方含药血清和VE能够消除细胞内m6A甲基化修饰,减少TFEB mRNA与m6A的结合量,恢复TFEB的mRNA转录水平和蛋白表达水平;6)益肾清利活血方含药血清抑制细胞内m6A甲基化修饰是依赖METTL3蛋白完成的,通过降低METTL3活性,抑制细胞内m6A甲基化修饰,上调TFEB的蛋白表达水平,从而发挥修复受损自噬流、延缓衰老抗RF的作用。结论:1)“单侧肾切除+D-gal腹腔注射”能够建立肾脏衰老和RF动物模型,D-gal以200 mM干预24h能够建立NRK-52E细胞衰老和RF细胞模型;2)益肾清利活血方及其含药血清在体内外具有延缓肾脏衰老抗RF的作用;3)益肾清利活血方及其含药血清在体内外具有修复受损自噬流的作用;4)益肾清利活血方及其含药血清延缓肾脏衰老抗RF的潜在分子机制是调控自噬流相关TFEB mRNA上m6A甲基化修饰水平完成的;5)益肾清利活血方含药血清抑制细胞内m6A甲基化修饰是依赖METTL3蛋白完成的。