背景创伤性脊髓损伤(spinal cold injury, SCI)是一种高致残性的疾病,常导致SCI患者损伤平面以下肢体的感觉和运动功能障碍,严重影响患者后期的生活质量。当前不论在发达国家还是发展中国家,SCI的发病率仍较高,并且总发病人数逐年上升,给患者家庭和全社会带来了严重的经济负担。SCI的病理生理机制十分复杂,包括原发性害和继发性损害两个阶段。原发性损伤阶段主要是由物理打击直接造成脊髓组织的机械性破坏,以损伤部位为中心出血、缺血及坏死等为特征；继发性损伤是由原发性损伤序贯性激活局部和全身的炎症反应及损伤后的适应性改变等引起的细胞死亡或退变。继发性损伤在创伤后短时间内启动,并且持续时间长,可以造成更多的神经元退变或死亡,对神经系统的损伤不亚于原发性损伤。因此,如何阻止或减轻继发性损害对神经系统的影响是SCI治疗的重心和研究切入点。然而尽管对于SCI的治疗人们做了大量的研究工作,但是目前仍然没有取得实质性的进展。我们发现既往研究主要集中在采取措施促进损伤部位脊髓的再生,没有过多的关注与脊髓紧密相连的大脑在SCI后有何变化,而我们此前的研究发现SCI后大脑部分区域出现了萎缩,以初级运动皮层萎缩最为明显,并且与患者的功能恢复有密切关系；另外已经证实SCI后大脑运动皮层细胞可以出现凋亡。因此我们推测大脑运动皮层的萎缩可能对SCI患者的功能恢复产生阻碍作用,而凋亡可能是引起大脑运动皮层萎缩的重要原因。因为假设位于大脑运动中枢的胞体已经发生了结构和功能改变,再生或修复的轴突不能与大脑相应中枢形成有效的突触连接,即使脊髓断端轴突完全再生也很难达到肢体功能完全恢复的目的。但是目前关于SCI后大脑运动皮层萎缩及细胞的凋亡机制尚未明确。既往的研究证实神经元的凋亡有两种方式,即caspase依赖性的凋亡途径和caspase非依赖性途径。其中在caspase依赖性途径中起关键作用的酶是cleaved caspase-3,其被激活后使细胞最终走向凋亡；而caspase非依赖性途径主要是由凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor, AIF)介导。AIF是存在于线粒体内膜和外膜之间的一种黄素蛋白,同时具有氧化还原酶活性和凋亡诱导活性的双重功能,但两种功能间是脱偶联的。当AIF被水解激活后可迅速进入细胞质,可以与细胞核结合使染色质凝集、将DNA水解为小片段,促进细胞凋亡。线粒体功能障碍是引起AIF水解的重要因素。Tau蛋白是一种微管相关蛋白,正常情况下与微管结合,但在被糖元合成酶激酶3β(glycogen synthasekinase-3β, GSK-3β)催化发生磷酸化后可以从微管脱落,引起微管稳定性下降或解聚。Tau蛋白磷酸化和去磷酸化之间的平衡是维持神经元微管稳定性、保证细胞完成线粒体等细胞器在轴浆中正常运输的前提。在创伤性脑损伤的研究中发现tau蛋白过度磷酸化可以引起微管解聚、线粒体分布异常和线粒体功能障碍,最终导致了神经元退变或凋亡。但是关于脊髓损伤后大脑运动皮层是否出现tau蛋白过度磷酸化及其与大脑运动皮层神经元凋亡之间的关系,目前尚无相关报道。因此深入了解SCI后大脑运动皮层神经元的凋亡机制,对完善SCI的病理生理机制、制定综合治疗措施具有重要意义。目的本研究拟通过结合不同的方法检测不同伤程度的SCI大鼠大脑运动皮层细胞的凋亡情况、磷酸化的tau蛋白(phosphorylated tau, p-tau)及与凋亡途径中重要的蛋白(cleaved caspase-3和AIF)的动态表达变化,以明确大脑运动皮层神经元的凋亡方式,并探究tau蛋白过度磷酸化在启动凋亡中的作用；另外早期应用LiCl抑制tau蛋白磷酸化,观察大脑运动皮层细胞的凋亡变化和运动功能的变化情况,最终初步阐明SCI后大脑运动皮层神经元发生凋亡的机制,为SCI的治疗提供新的理论基础和实验基础。方法本研究包括两个实验阶段：1、在第一个实验阶段,120只平均体重为230g左右的SD (Sprague-dawley)雌性大鼠随机分为Sham组、轻度SCI组、中度SCI组和重度SCI组。Sham组只去除T8的椎板、暴露硬膜即可,不损伤脊髓；SCI组大鼠在显露T8脊髓硬膜后,在NYU-MASCIS脊髓损伤系统中用l0g的金属杆分别自125mm、250mm、500mm的高度自由下落打击T8节段脊髓背侧正中,即轻度SCI组、中度SCI组和重度SCI组脊髓受到打击能量分别为125g×mm、250g ×mm和500g×mm,制作不同损伤程度的SCI模型。在损伤后1d、3d、7d、14d和28d分别对大鼠进行BBB评分,再采用10%水合氯醛过量麻醉法处死大鼠,根据检测要求的不同取大鼠的损伤段脊髓和大脑运动皮层(M1区)组织于不同条件下保存待测。主要的检测方法和指标有：(1)脊髓组织苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色,观察造模后脊髓组织结构的损伤情况；采用TUNEL染色观察大脑运动皮层细胞的凋亡情况,并计数TUNEL染色阳性的细胞核,计算凋亡指数(apoptosis index, AI); (2) Western blot检测大脑运动皮层的caspase-3、AIF和tau蛋白的表达变化,采用Image Pro Plus 6.0测定灰度值,计算各时间点各蛋白的相对量并比较各组间的差异性；(3)采用免疫荧光染色标记AIF和p-tau共定位情况,同时计算AIF和p-tau双标阳性的神经元计数,并比较各组间的差异。(4)采用相关性分析,计算上述检测指标的相关性。2、在第二阶段实验中,30只10±2W龄、平均体重约230g的SD(Sprague-dawley)雌性大鼠随机分为sham组、SCI+LiCl组和SCI+NaCl组。Sham组造模时只去除T8的椎板、暴露硬膜,不损伤脊髓；将SCI组大鼠固定于NYU-MASCIS打击器上,用250g×mm的打击能量打击T8节段脊髓,损伤后SCI+LiCl组大鼠立即予以20mg/kg. b. w的剂量的LiCl溶液腹腔注射,SCI+NaCl组则腹腔注射相同比例体积的生理盐水,此后每日注射1次,连续应用3天。观察指标和方法：(1)在损伤后1W时每组取6只大鼠取大鼠大脑运动皮层组织,采用TUNEL染色法观察各组大脑运动皮层神经元的凋亡情况,采用Western blot检测p-tau和AIF的表达情况；(2)在1W、2W、3W和4W对大鼠进行BBB评分,观察后肢运动功能变化。结果第一阶段的实验结果：(1)SCI后1d大鼠脊髓损伤段HE染色结果显示不同损伤程度的大鼠脊髓组织的破坏程度不同,提示成功制作了不同损伤程度的大鼠模型；(2)SCI大鼠大脑皮层早期即可出现细胞的凋亡,并且在损伤后第7天凋亡指数达到峰值,损伤越重AI越大,组间比较差异有统计学意义,7d的AI与28d大鼠的BBB评分呈负相关关系(r=0.873,P<0.05),7d以后虽有减轻,但仍维持在较高水平。(3)大脑运动皮层p-tau与AIF的表达存在时空变化关系。大脑运动皮层M1区Western blot结果显示sham组的cleaved caspase-3、AIF和p-tau在观察期内表达无明显变化；Mod SCI组和Sev SCI组的cleaved caspase-3仅在7d、14d及28d时有轻度上升,但是与Sham组和Mil SCI组相比较差异均无统计学意义(P>0.05)；而caspase非依赖性途径中起关键作用的AIF的表达在SCI后显著上升,在7d时达到峰值,此后表达有所降低,但SCI组的AIF仍显著高于Sham组,在相同的时间点损伤程度越重AIF的表达越高,组间相比差异均有统计学意义(P<0.05); p-tau在SCI后早期也显著升高,峰值的的出现时间与AIF一致,相关性分析发现二者的表达具有正相关关系(r=0.827,P<0.01)；免疫荧光的结果证实了p-tau与AIF有共定位关系,同时7d时的p-tau与AIF共定位阳性细胞计数达到最大值,与28d时BBB评分呈正相关关系(r=-0.852,P<0.01)。第二阶段的实验结果：(1)抑制tau蛋白磷酸化,可显著降低SCI大鼠大脑运动皮层细胞的凋亡。7d时SCT+LiCl组大脑运动皮层p-tau和AIF与SCI+NaCl组相比均显著下降(P<0.05),并伴随着凋亡指数的下降(P<0.05)；(2)抑制tau过度蛋白磷酸化可促进SCI大鼠运动功能的恢复：与SCl+NaCl相比,SCI+LiCl组从2周起BBB评分有明显提高,在3W和4W时两组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.脊髓损伤后大脑运动皮层在早期便可发生细胞凋亡,与脊髓损伤程度有相关性,损伤越重引起大脑皮层凋亡的细胞越多；脊髓损伤后大脑运动皮层持续性的细胞凋亡可能是引起大脑运动皮层萎缩的重要原因。2.脊髓损伤后大脑运动皮层细胞的凋亡方式可能主要由AIF介导的非caspase依赖性途径；脊髓损伤后大脑运动皮层tau蛋白过度磷酸化可能在AIF的激活过程中起了重要作用。3.抑制tau蛋白过度磷酸化可以减轻脊髓损伤后大鼠大脑运动皮层细胞的凋亡,并且在一定程度上促进大鼠运动功能的恢复,因此如何精确地减轻脊髓损伤后大脑运动皮层tau蛋白过度磷酸化可能是脊髓损伤治疗的一个新靶点,但是需要深入研究脊髓损伤后大脑运动皮层tau蛋白过度磷酸化在启动细胞凋亡的具体机制,以争取早期、精确、有效的采取干预措施,最大限度恢复脊髓损伤患者的功能。