【摘 要】
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研究目的本实验旨在通过观察人腹膜间皮细胞（Human peritoneal mesothelial cells,HPMC）在肿瘤坏死因子α（Tumour necrosis factor-α,TNF-α）引导后的炎症状态下,由川号嗪进行干预,根据干预前后Ⅰ型胶原（Ⅰ Collagen,Col Ⅰ）表达及基质金属蛋白酶1（Matrix metalloproteinase,MMP-1）、基质金属蛋白酶抑
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研究目的本实验旨在通过观察人腹膜间皮细胞（Human peritoneal mesothelial cells,HPMC）在肿瘤坏死因子α（Tumour necrosis factor-α,TNF-α）引导后的炎症状态下,由川号嗪进行干预,根据干预前后Ⅰ型胶原（Ⅰ Collagen,Col Ⅰ）表达及基质金属蛋白酶1（Matrix metalloproteinase,MMP-1）、基质金属蛋白酶抑制剂 1（Tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP-1）表达的区别,论证川芎嗪是否具有保护肿瘤坏死因子诱导下炎症状态的人腹膜间皮细胞的作用,从实验数据出发,为论证川芎嗪对腹膜纤维化的防治意义提供科学的细胞实验理论依据。研究方法大网膜组织的取材排除了尿毒症以及患有腹膜炎症的患者,并满足:南京鼓楼医院的患者且择期在普外科行腹部手术,取材自这部分患者的捐献,从筛选取得的大网膜组织中,分离间皮细胞,分离过程使用胰蛋白酶消化法,并且进行传代、培养,最终,培养的第三代生长融合细胞即可用于实验。将其按每组三个样本,共5组进行实验:包括N组,即为空白对照组（完全培养液）,设置H组为TNF-α（1000ng/L）诱导组,随后按川芎嗪不同规格分为L1组即低剂量川芎嗪组,设置TNF-α和10mg/L的川芎嗪、L2组即中剂量川芎嗪组,设置TNF-α和20mg/L的川芎嗪和L3组即高剂量川芎嗪组,设置TNF-α和40mg/L的川芎嗪。用含有15%FCS的RPMI-1640培养液（完全培养液）将各组容量分别补充至200u1（96孔培养板）和10ml（T75培养瓶）。对HPMCs的活性进行检测,方法采用MTT法,对细胞上清液中的Ⅰ型胶原,MMP-1和TIMP-1蛋白水平进行检测,方法采用ELISA法,对细胞内Ⅰ型胶原,MMP-1和TIMP-1mRNA的表达水平进行检测则采用半定量RT-PCR。研究结果1.人腹膜间皮细胞培养与鉴定:人腹膜间皮细胞经分离培养后,用光镜对其形态学进行观察,可以发现呈铺路鹅卵石状,根据形态学特点,纯度达到95%以上;经鉴定,根据细胞表面标志显示的结果,符合呈现出阳性的为角蛋白及波形蛋白抗原,呈现出阴性的为第Ⅷ因子相关抗原及白细胞CD45抗原,可确定人腹膜间皮细胞分离培养成功。2.MTT检测细胞活性:观察细胞活力,发现其在TNF-α诱导下下降,经过川芎嗪的干预,监测人腹膜间皮细胞MTT A值发现显著高于对照组（P＜0.01）,且其干预作用与药物浓度相关,药物浓度升高其干预作用也随之提高,根据结果,可以证明川芎嗪对TNF-α诱导所致炎症状态下的腹膜间皮细胞活力减弱起到抑制作用。3.ELISA、RT-PCR检测Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶1和基质金属蛋白酶试剂1在蛋白、基因水平的表达:人腹膜间皮细胞在TNF-α作用下增加Ⅰ型胶原和基质金属蛋白酶抑制剂1的表达,而降低基质金属蛋白酶1的表达,经过川芎嗪的干预,发现与对照组相比含量显著下降的为Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶抑制剂1（P＜0.01）,含量显著提高的为基质金属蛋白酶1（P＜0.01）,且此变化与川芎嗪剂量相关,此结果证实,川芎嗪具有抑制Ⅰ型胶原的表达水平,同时调整基质金属蛋白酶1及其抑制剂表达水平的平衡,以实现控制人腹膜间皮细胞纤维化过程的作用。结论1.在TNF-α诱导之下人腹膜间皮细胞进入炎症状态,上调人腹膜间皮细胞Ⅰ型胶原及TIMP-1的表达,下调MMP-1的表达。2.川芎嗪可下调腹膜间皮细胞炎症状态下表达的Ⅰ型胶原及TIMP-1,且可上调此状态下MMP-1的分泌与表达。3.对比川芎嗪干预前后Ⅰ型胶原、TIMP-1及MMP-1的合成与表达的变化,可以发现川芎嗪最终得以实现抗纤维化的目的与其能够调高MMP-1的表达,减低Ⅰ型胶原及TIMP-1的表达,达到MMP-1/TIMP-1表达的平衡密切相关。
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