hTHEM2功能以及微管蛋白翻译后修饰研究

来源 :中国科学院生物物理研究所 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jinr0op3
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本文采用免疫共沉淀的方法发现hTHEM2能与微管蛋白共沉淀,免疫荧光显示表达的hTHEM2也能结合到利用纯化的微管蛋白体外聚合形成的微管上面,证明hTHEM2能直接结合到微管上面。另外设计了抑制hthem2基因表达的siRNA序列并将其插入pU6+1-GFP载体中,瞬时转染U20S细胞,72小时后将细胞免疫染色,统计结果显示高达74%的被转染且处于有丝分裂中期的细胞出现多极纺锤体,而对照组仅为10%。纺锤体的形成和维持需要多种蛋白的协同作用,hTHEM2在此过程中的作用机制有待进一步研究。   微管是细胞骨架的重要组成部分,承担一系列重要的生物学功能。微管功能多样性的产生主要是由于两个方面:一是产生不同的α,β微管蛋白亚型,另外就在于一系列可逆的翻译后修饰,例如乙酰化、多聚甘氨酰化、多聚谷氨酰化、酪氨酸化/去酪氨酰化、磷酸化和棕榈酰化等等。一般来说,棕榈酰化能增加微管蛋白与膜的结合从而影响微管的定位与功能。Ellman反应显示,微管蛋白在体外被自动棕榈酰化以后,棕榈酰基能被hTHEM2去除,提示hTHEM2可能是一种去棕榈酰化酶。本文利用N-乙酰马来酰亚胺将已棕榈酰化的微管蛋白的剩余巯基封闭,然后在羟胺的作用下将棕榈酰基与巯基之间的硫脂键打断并用HPDP-biotin封闭,酶解后用streptavidin agarose富集HPDP-biotin标记的多肽,最后利用质谱技术对上述肽段进行了鉴定,从而确定了棕榈酰化位点。   血浆蛋白质组计划(HPPP)的首要目标是全面分析血浆的蛋白质组成,但是血浆中的蛋白质种类可达上万种,其中的大部分为含量极低的蛋白质,血浆蛋白溶度的动态变化范围至少在九个数量级以上。因此在鉴定血浆蛋白之前必须尽量除去其中的高丰度蛋白。本文应用Albumin and IgG Removal Kit,HiTrap blue and HiTrap protein Gcolumns以及Seppro,TM MIXED12 liquid chromatography(LC) column去除血浆中的高丰度蛋白,发现Albumin and IgG Removal Kit,HiTrap blue and HiTrap protein G columns在去除HSA和IgG同时,也能非特异性去除其它蛋白,而SepproTM MIXED12 liquidchromatography(LC) column由于采用将12种高丰度蛋白相应抗体耦联在色谱柱上的方法,2D-PAGE结果显示该方法增加了去除高丰度蛋白种类的同时,非特异性吸附较少,保证了血浆蛋白鉴定的完整性。
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