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研究目的与意义急性肾损伤（acutekidney injury,AKI）是一种以肾小球滤过率急剧下降为主要特征的临床综合征,AKI具有较高的发病率与死亡率和发展为慢性肾病的风险,已成为世界范围内的一项公共安全问题。肾缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）是诱发AKI的主要原因之一。AKI致病机制较为复杂,其中活性氧（reactiveoxygen species,ROS）介导的氧化应激是I/R诱导的AKI的重要致病机制之一。ROS是有氧代谢的副产物。正常生理条件下,基础水平的ROS可以调节细胞增殖、免疫反应、细胞分化、代谢途径和信号转导等重要事件。但ROS过低或过高都会对细胞产生不良影响,其中ROS水平过高、超过细胞的ROS清除能力时,则会与细胞内各种生物大分子发生氧化反应,导致细胞氧化损伤,引起线粒体损伤,激活铁死亡等细胞死亡方式。因此,减少ROS的过量生成、清除过量ROS,从而减轻线粒体损伤、预防细胞铁死亡是AKI潜在的治疗方法。纳米材料通常是指尺寸大小为1-100纳米的材料,纳米酶是指具有酶模拟活性的纳米材料。与天然酶相比,纳米酶具有高催化稳定性、易于修饰、制备简单、成本低的特点,因此成为天然酶的良好替代品。某些金属纳米酶具有优良的类超氧化物岐化酶（superoxide dismutase,SOD）、过氧化氢酶（catalase,CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GPx）活性,使其在抗氧化方面具有广泛的应用潜力。锰（Mn）为人体所需生命元素,以Mn为活性中心的SOD酶在治疗急性疾病方面比Cu/Zn SOD和Fe/Ni SOD具有更大优势。近年来锰基纳米酶引起广泛关注,其中Mn3O4纳米酶由于其表面同时存在Mn2+、Mn3+的双重氧化态,使其同时具有SOD、CAT、GPx活性,因此成为良好的清除ROS的抗氧化剂,但目前锰基纳米材料用于AKI治疗的研究还未见报道。考虑到肾小球滤过屏障对纳米颗粒尺寸的严格限制,本论文拟设计超小Mn3O4纳米酶,以清除AKI肾脏中过量的ROS,对AKI发挥保护作用。研究方法和结果采用乙酸锰、油胺、油酸和十八烯作为底物,通过热分解法合成Mn3O4纳米颗粒,并进行表面二巯基丁二酸（dimercaptosuccinic acid,DMSA）修饰。使用透射电镜（transmissionelectronmicroscopy,TEM）观察、X 射线衍射（X-ray diffraction,XRD）、动态光散射（dynamic light scattering,DLS）检测及nano measurer软件统计等方法,发现纳米颗粒分散性良好,尺寸约为4 nm、化学成分为Mn3O4,实现超小Mn3O4纳米颗粒的合成;相转实验结果显示DMSA修饰促进纳米颗粒从油相向水相转移。X射线光电子能谱（X-ray photoelectronspectroscopy,XPS）结果证明超小Mn3O4纳米颗粒表面同时存在Mn2+和Mn3+。过氧化物酶（Peroxidase,POD）、GPx及SOD活性检测证实超小Mn3O4纳米颗粒同时具有POD活性、GPx活性和SOD活性。Zeta电位分析证明超小Mn3O4纳米酶储存稳定性较好;通过live-dead染色显示人肾小管上皮HK-2细胞在高浓度（50μg/mL）Mn3O4纳米酶处理时生存良好。体外缺氧-复氧处理HK-2细胞构建体外AKI模型,给予超小Mn3O4纳米酶检测细胞损伤。流式细胞术和live-dead结果显示超小Mn3O4纳米酶显著减轻HK-2细胞的死亡;ROS水平检测、Mitosox Red染色观察结果显示超小Mn3O4纳米酶可以有效清除细胞内和线粒体ROS水平;使用JC-1染色、Mitotracker Green染色和透射电镜观察等发现超小Mn3O4纳米酶可显著改善缺氧-复氧刺激引起的线粒体膜电位异常和线粒体结构损伤;免疫印迹结果证实经超小Mn3O4纳米酶处理后可部分地恢复缺氧-复氧处理的HK-2细胞中的SDHB和COXIV表达。构建I/R诱导的小鼠AKI模型并给予超小Mn3O4纳米酶治疗。血清生化指标检测显示经治疗后小鼠肌酐和尿素氮水平较模型组小鼠明显降低;H＆E染色结果显示超小Mn3O4纳米酶能够有效改善I/R引起的肾脏形态学损伤特征;免疫组织化学染色观察发现超小Mn3O4纳米酶治疗显著减少I/R引起的损伤相关分子KIM-1表达升高和中性粒细胞浸润;TUNEL染色结果显示超小Mn3O4纳米酶能够减轻I/R引起的肾小管上皮细胞死亡;透射电镜观察证明超小Mn3O4纳米酶治疗后I/R引起的肾小管上皮细胞线粒体损伤得到明显改善。利用MDA检测试剂盒及免疫组织化学染色标记MDA,分别检测细胞和肾脏组织脂质氧化水平的影响,结果显示超小Mn3O4纳米酶可抑制体外和小鼠AKI模型中脂质过氧化。亚铁离子荧光探针检测证明H/R刺激引起的HK-2细胞中Fe2+含量上升可被超小Mn3O4纳米酶所降低;免疫印迹检测发现超小Mn3O4纳米酶可抑制体外和小鼠AKI模型中Transferrin表达的升高。研究结论与创新性本论文针对肾小球滤过屏障的尺寸限制,设计并制备获得超小尺寸（约4nm）、具有稳定分散性的Mn3O4纳米酶。超小Mn3O4纳米酶可通过自身的类酶活性清除ROS、保护线粒体,从而减轻I/R诱导的AKI。本论文首次制备了超小Mn3O4纳米酶并应用于AKI模型的治疗,并证实超小Mn3O4纳米酶对AKI的保护性作用。