【摘 要】
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研究背景:光照和温度是调控季节性繁殖的两个重要生态因子。黑线仓鼠主要分布在北温带,具有典型的季节性繁殖节律。睾丸是雄性哺乳动物最重要的生殖器官,是精子发生以及睾酮合成的主要场所,正常的结构是维持睾丸功能的必要前提。线粒体是哺乳动物睾丸中最重要的细胞器之一,参与睾丸中诸多的生理过程,已有研究表明线粒体稳态失衡会影响精原细胞分化、减数分裂和精子发生,因此线粒体稳态的维持是睾丸行使正常功能的前提。线粒体
【基金项目】
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国家自然科学基金32072436、31770455、31972283 和 31800308项目；
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研究背景:光照和温度是调控季节性繁殖的两个重要生态因子。黑线仓鼠主要分布在北温带,具有典型的季节性繁殖节律。睾丸是雄性哺乳动物最重要的生殖器官,是精子发生以及睾酮合成的主要场所,正常的结构是维持睾丸功能的必要前提。线粒体是哺乳动物睾丸中最重要的细胞器之一,参与睾丸中诸多的生理过程,已有研究表明线粒体稳态失衡会影响精原细胞分化、减数分裂和精子发生,因此线粒体稳态的维持是睾丸行使正常功能的前提。线粒体稳态的调节可能会影响到线粒体数量以及线粒体的能量供应能力,同时可能受到细胞凋亡、线粒体自噬及线粒体分裂信号通路的调节。本研究以黑线仓鼠作为研究对象,探究了光照以及温度对睾丸结构与功能的影响,并从线粒体稳态调控相关通路的角度探究了导致这种影响的分子机制。研究方法及内容:选取24只成年雄性黑线仓鼠并随机分为四个组,每组各6只,进行为期8周的光照和温度处理:即中光照中温组（MM,12h:12h,06:00～18:00,22℃）,中光照轻度低温组（ML,12h:12h,06:00～18:00,15℃）,短光照中温组（SM,10h:14h,08:00～16:00,22℃）,短光照轻度低温组（SL,10h:14h,08:00～16:00,15℃）。处理结束后将黑线仓鼠处死,将睾丸取出进行后续的研究:（1）对睾丸进行称重,以衡量不同处理下睾丸重量的变化。（2）采用HE染色的方法观察睾丸结构的变化,同时采用酶联免疫法（ELISA）对睾丸组织内的睾酮激素浓度进行检测。（3）采用透射电镜（TEM）对生精细胞结构及线粒体结构进行观察,并统计单个细胞内的线粒体数目。（4）通过蛋白质免疫印迹法对细胞凋亡相关蛋白bax、bcl2进行蛋白定量,采用酶联免疫法（ELISA）对caspase3进行酶活水平检测,衡量睾丸细胞凋亡水平变化,同时采用TUNEL染色技术观察睾丸细胞凋亡。（5）通过蛋白质免疫印迹法对线粒体供能功能相关蛋白ATP synthase、CS进行蛋白定量,并采用酶联免疫法（ELISA）检测其酶活水平,衡量线粒体能量供应能力的变化。（6）通过蛋白质免疫印迹法对线粒体自噬与线粒体分裂相关蛋白PINK1、Parkin、P-Parkin、DRP1、FIS1进行检测,探究线粒体自噬以及线粒体分裂水平的变化。研究结果:（1）与MM组相比,SM、SL组黑线仓鼠体重和睾丸质量均有所下降,而ML组无显著变化。（2）与MM组相比,SM和SL组睾丸生精小管直径与生精上皮厚度减小,说明睾丸发生了萎缩,与此同时,SM和SL组的睾酮水平也有所下降,表明短光照会导致黑线仓鼠睾丸功能损伤。与MM组相比,ML组睾丸生精小管直径减小,但生精上皮厚度、睾酮浓度没有发生显著变化,说明轻度低温对睾丸结构与功能的影响较小。（3）与MM组相比,ML、SM、SL组睾丸细胞内的线粒体肿胀,线粒体嵴稀疏,说明短光照以及轻度低温均会导致线粒体结构损伤。同时SM、SL组的线粒体数量明显减少,说明短光照能导致线粒体数目降低。（4）与MM组相比,虽然ML、SM、SL组的ATP合酶的蛋白表达量以及酶活水平没有发生显著性变化,但是柠檬酸合酶的蛋白表达量在三个处理组中均降低,提示短光照和轻度低温都可能导致线粒体的能量供应能力减弱。（5）与MM组相比,SM、SL组bax/bcl2蛋白质的表达量及caspase3活性均升高,TUNEL染色的结果显示SM、SL组有大量的DNA片段化,说明短光照会导致睾丸细胞凋亡水平升高。（6）与MM组相比,DRP1蛋白表达量在ML、SM、SL组中均无差异,同时FIS1蛋白表达量在ML、SM、SL组中均显著降低,说明短光照和轻度低温可以导致线粒体分裂水平升高。（7）与MM组相比,PINK1蛋白表达量在ML和SL组显著升高,提示轻度低温会导致线粒体自噬水平升高。结论:短光照会导致黑线仓鼠睾丸出现退行性变化,包括睾丸结构受损,睾丸合成和分泌睾酮的功能减弱;而轻度低温对于睾丸结构与功能的影响较小。短光照以及轻度低温均会降低线粒体的供能能力,这是由于线粒体的有氧氧化能力降低导致的。短光照下睾丸细胞凋亡水平升高可能是睾丸结构与功能受损,同时线粒体供能能力降低的主要原因;而轻度低温下线粒体分裂水平与线粒体自噬水平的共同升高对睾丸内线粒体稳态的调节起到了相互制约的作用。
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