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背景与目的神经病理性疼痛(Neuropathic pain,NP)是一种使大约3～8%的人口都为之困扰的慢性疼痛,常给病人带来极大痛苦,因其机制不清楚,往往缺乏有效治疗手段。因此,越来越多的研究已经着眼于对其病理学机制的认识。以往研究认为外周敏化和中枢敏化在NP的产生和维持过程中均发挥着重要的作用。背根神经节(Dorsal root ganglion,DRG)中神经元作为痛觉传导的第一级神经元,在外周敏化和中枢敏化的传递过程中发挥桥梁作用。DRG中初级神经元的异常活动与神经损伤所致的NP有关,这些神经元的异常兴奋性可增强外周敏化,并与DRG中疼痛相关受体、酶、电压依赖性离子通道等基因的表达变化有关。瞬时感受器电位香草酸受体 1(Transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1)是一种非选择性阳离子通道,作为各种伤害性刺激的主要整合单元,可以调节各种信号通路下游功能的变化,使中枢神经系统和周围神经系统中自身的活性不断恢复和增强,导致异常激活而触发和维持慢性疼痛。然而对于TRPV1的表达调控机制目前仍缺乏深入研究。本课题组前期研究已经发现CCI大鼠DRG中转录因子髓样锌指蛋白1(Myeloid zinc finger 1,MZF1)参与电压门控性钾通道(Voltage-gated K+ channels,Kv)基因的表达调控从而介导神经病理性疼痛的产生,TRPV1通道与Kv通道结构类似,但MZF1是否参与TRPV1的转录和表达调控,介导神经病理性疼痛的发生和维持,仍需进一步研究。本研究拟采用大鼠坐骨神经慢性压迫损伤模型(Chronic constriction injury,CCI),观察CCI对L4/5 DRG中MZF1与TRPV1表达的影响,并验证MZF1与TRPV1在NP中的作用,利用DRG显微注射技术过表达或基因沉默MZF1观察对TRPV1表达的影响以及探索MZF1与TRPV1启动子区域的结合情况,从而探讨MZF1调控TRPV1的表达介导NP发生发展的分子机制,为NP探索新的治疗靶点。材料与方法1大鼠CCI术后DRG中MZF1和TRPV1的表达变化雄性SD大鼠随机分为2组:实验组(CCI组)和对照组(Sham组),连续测量大鼠术侧后足机械性撤足阈值(Paw withdrawal threshold,PWT)和热缩足潜伏期(Paw withdrawal latency,PWL)至术后 14 天,利用 RT-PCR 和 Western Blot技术分别检测L4/5 DRG中MZF1与TRPV1转录水平以及蛋白表达水平的变化情况。2大鼠DRG中MZF1在NP发生与维持阶段的作用(1)大鼠DRG中MZF1过表达对NP的影响雄性SD大鼠随机分为2组:rAAV5-MZF1组和rAAV5-EGFP组,对正常大鼠DRG显微注射rAAV5-MZF1或rAAV5-EGFP,随后测量大鼠PWT和PWL。(2)大鼠DRG中MZF1基因沉默对NP的影响雄性SD大鼠随机分为4组:Sham +Vehicle组、CCI + Vehicle组、CCI +MZF1 siRNA组和CCI + MZF1 scrRNA组。采用大鼠CCI术前预先DRG显微注射的方式并测量其PWT和PWL。另取一批雄性SD大鼠随机分为4组:Sham+Vehicle 组、CCI + Vehicle 组、CCI + MZF1 siRNA 组和 CCI + MZF1 scrRNA 组。大鼠CCI术后7天采用DRG显微注射的方式并测量其PWT和PWL。3大鼠DRG中MZF1调控TRPV1的表达介导NP的分子机制(1)大鼠DRG中MZF1过表达和基因沉默对TRPV1表达变化的影响雄性SD大鼠随机分为2组:rAAV5-MZF1组和rAAV5-EGFP组,采用对正常大鼠DRG显微注射rAAV5-MZF1或rAAV5-EGFP,3周后取材L4/5 DRG,利用RT-PCR和Western Blot检测MZF1和TRPV1表达变化。另取一批雄性SD大鼠随机分为 4 组:Sham +Vehicle 组、CCI + Vehicle 组、CCI + MZF1 siRNA组和CCI + MZF1 scrRNA组。采用大鼠CCI术前预先DRG显微注射相应试剂的方式,于CCI术后7天取材L4/5 DRG,利用RT-PCR和Western Blot检测MZF1和TRPV1表达变化。(2)CCI大鼠DRG中MZF1与TRPV1启动子区域的结合情况取雄性SD大鼠3只,施行CCI模型手术,于术后3天取L4/5 DRG并利用染色质免疫共沉淀技术(Chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)检测 MZF1与TRPV1启动子区域的结合情况。(3)抑制大鼠DRG中TRPV1表达在NP发生与维持阶段的作用将24只雄性SD大鼠随机编号分为4组:Sham +Vehicle组、CCI + Vehicle组、CCI +TRPV1 siRNA 组和 CCI + TRPV1 scrRNA 组。采用大鼠 CCI 术前预先 DRG显微注射的方式并测量其PWT和PWL。另取24只雄性SD大鼠随机分为4组:Sham +Vehicle 组、CCI + Vehicle 组、CCI + TRPV1 siRNA 组和 CCI + TRPV1 scrRNA组。大鼠CCI术后7天采用DRG显微注射的方式并测量其PWT和PWL。结果1大鼠CCI手术引起痛觉过敏现象以及DRG中MZF1与TRPV1表达上调CCI手术引起大鼠术侧后足机械性痛觉超敏和热痛觉过敏。痛行为学测试显示大鼠CCI术后3天PWT和PWL开始出现明显的下降,并可持续到术后14天。RT-PCR结果显示CCI大鼠DRG中MZF1 mRNA和TRPV1 mRNA表达明显升高。Western Blot数据证实CCI大鼠DRG中MZF1和TRPV1的蛋白表达也出现显著的上调。2大鼠DRG中MZF1在NP发生与维持阶段的作用DRG显微注射rAAV5-MZF1可以引起正常大鼠痛觉过敏现象。与rAAV5-EGFP组相比,rAAV5-MZF1组大鼠PWT和PWL发生明显下降。痛行为学数据也证实DRG中过表达MZF1可以加重CCI大鼠痛觉过敏。与rAAV5-EGFP组相比,rAAV5-MZF1组大鼠PWT和PWL发生进一步的下降。行为学测试证实,与CCI + Vehicle组相比,预先DRG显微注射MZF1 siRNA(CCI术前3天)可以显著升髙CCI大鼠PWT和PWL。为进一步证实MZF1在NP维持阶段的作用,痛行为学数据显示,与溶剂组(CCI + Vehicle组)相比,MZF1基因沉默组(CCI +MZF1 siRNA,CCI术后7天DRG显微注射)大鼠术侧后足PWT和PWL出现明显升高。3 CCI大鼠DRG中MZF1通过调控TRPV1的表达介导NP发生的分子机制RT-PCR和Western Blot结果显示大鼠DRG显微注射rAAV5-MZF1可以诱发TRPV1 mRNA和TRPV1蛋白表达升高。而预先DRG显微注射MZF1 siRNA可以显著抑制CCI引起的TRPV1 mRNA和TRPV1蛋白的上调。染色质免疫共沉淀技术证实,MZF1可以直接结合TRPV1基因启动子区域。痛行为学数据显示,与CCI + Vehicle组相比,预先DRG显微注射TRPV1 siRNA(CCI术前3天)可以明显升髙CCI大鼠PWT和PWL。为进一步证实TRPV1在NP维持阶段的作用,痛行为学测试结果证实,与溶剂组(CCI +Vehicle组)相比,TRPV1基因沉默组(CCI + MZF1 siRNA,CCI术后7天DRG显微注射)大鼠术侧后足PWT和PWL出现显著升高。实验结论上述结果提示大鼠坐骨神经慢性压迫损伤可以引起DRG中转录因子MZF1的表达上调,MZF1与TRPV1启动子区域结合调控TRPV1表达升高,从而介导神经病理性疼痛的发生发展。本研究的主要创新点如下:1本研究结果提示大鼠坐骨神经慢性压迫损伤可以引起DRG中转录因子MZF1的激活,从而调控TRPV1的表达上调介导神经病理性疼痛的发生,该理论目前国内外尚未研究报道,并且具有一定的理论创新性,为神经病理性疼痛的分子机制进一步研究提供了新的思路。2通过抑制MZF1和TRPV1的表达,可以调控神经病理性疼痛的发生和维持,为寻找神经病理性疼痛的治疗靶点提供了新的思路和目标。这些问题的明确将有助于研发神经病理疼痛针对性的药物或干预措施。3方法创新:以往针对DRG研究活体干预的方法主要有经皮穿刺DRG注射术、椎间孔暴露DRG注射术、或者鞘内注射术等,主要问题:靶向性差,成功率低。本研究采用椎板切除DRG暴露直视注射术可极大地提高靶向性和成功率。该方法在国内应用较少。