目的:基于前期射干中抗炎、止咳药效物质基础及其作用机制研究,通过查阅本草典籍及现代文献发现,射干从古至今来源广泛,不同产地药材中药理活性成分含量差异较大,造成临床疗效不均一的现状。本专题参照我国七大地理区域分区标准,利用经纬度对射干古产地及现代主产地进行区域划分并从中收集实验用药材;以射干中药效物质基础为研究对象,采用HPLC法测定不同产地药材中抗炎、止咳药效成分含量,通过将含量测定结果与所在地区的气候、海拔、温度、降水量、日照时数及药材采收时间、生长年限等因素相关联,初步分析上述因素对药效成分含量的影响,进一步将含量测定结果与最佳配比相比对,初步探讨不同产地射干的主要药理活性,以期为药材临床应用提供参考。方法:1化学对照品研究本实验所用化学对照品包括:射干苷、鸢尾甲苷A、鸢尾甲苷B、野鸢尾苷、鸢尾黄素、鸢尾甲黄素B、鸢尾甲黄素A、野鸢尾黄素、次野鸢尾黄素、白射干素,其中鸢尾黄素、野鸢尾黄素、白射干素三种化学对照品为实验室自制。1.1化学对照品理化性质及结构研究依据《国家药品标准物质技术规范》相关规定,对实验室自制的三种化学对照品鸢尾黄素、野鸢尾黄素、白射干素进行相关检查,判断其是否符合含量测定用化学对照品要求。观察确定其性状、测定其熔点,并以甲醇、二甲基亚砜、三氯甲烷三种不同极性的溶剂考察其溶解性;通过紫外光谱大致确定化合物类型、红外光谱大致判断官能团类型、质谱判定其分子量、核磁氢谱及碳谱大致确定基团排布,联合确认对照品分子结构。1.2化学对照品纯度研究以薄层色谱法、高效液相色谱法、紫外光谱扫描进行杂质检查;并采用国际通用的质量平衡法定量对照品含量。2实验药材的选择依据本草考证、现代文献、网络查阅等信息初步确定射干药材古产地、现代主产地以及GAP药材基地的野生栽培情况,参照我国七大地理区域划分标准,利用经纬度进行区域划分,综合地理位置、气候、海拔等因素从上述区域内挑选产地,并按照药材不同的采收时间、生长年限从中选择具有代表性的实验药材样本。3不同产地射干药材初步评价研究3.1不同产地射干药效成分含量研究以射干中抗炎药效成分射干苷、鸢尾甲苷A、鸢尾甲苷B、野鸢尾苷、鸢尾黄素、鸢尾甲黄素B、鸢尾甲黄素A、野鸢尾黄素和止咳药效成分次野鸢尾黄素、白射干素为研究对象,采用高效液相色谱法,以0.1%磷酸水溶液、乙腈、0.72%甲基-β-环糊精-0.1%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,265nm波长检测,进一步对测定方法的线性范围、精密度、重复性、稳定性、加样回收率进行方法学考察,并利用此方法对来自12个产地33批次射干药材中药效成分含量进行测定,通过对测定结果进行聚类分析、对比分析,初步探讨射干药效成分含量的产地差异性,并分析气候、海拔、温度、降水量、日照时数以及药材采收时间、生长年限对药效成分含量的影响。3.2基于最佳配比的不同产地射干评价研究通过将测定得到的苷元类药效成分含量与最佳配比相对比,初步确定适合止咳应用的射干药材产地及区域。结果:1化学对照品研究结果实验室自制的三种化学对照品经紫外鉴别均为异黄酮类化合物,光谱解析确认其结构分别为5,7,4’-三羟基-6-甲氧基异黄酮、5,7,3’-三羟基-6,4’,5’-三甲氧基异黄酮、5,3’-二羟基-6,7-亚甲二氧基-4’,5’-二甲氧基异黄酮,结合性状、溶解性、熔点信息确定为鸢尾黄素、野鸢尾黄素、白射干素;经TLC、HPLC、HPLC-DAD扫描确定为单一纯物质;采用面积归一化法和自身对照法求得的对照品色谱峰纯度分别为99.69%、99.57%、99.22%,含水量分别为0.99%、0.96%、0.70%,以质量平衡法定量的含量分别为98.70%、98.61%、98.52%。2实验药材选择结果基于射干古产地、现代主产地的考证、网络查阅及调研,综合地理位置、气候、海拔等因素从七大区域中选出海南昌化、贵州黔西、四川成都、四川阿坝州、湖南长沙、湖北恩施、湖北黄冈、河南南阳、安徽亳州、陕西商洛、河北安国、辽宁沈阳作为实验药材产地,并进一步按照药材不同的采收时间、生长年限从中选出33批实验药材样本。3不同产地射干药效成分含量研究结果基于不同产地射干中抗炎药效成分射干苷、鸢尾甲苷A、鸢尾甲苷B、野鸢尾苷、鸢尾黄素、鸢尾甲黄素B、鸢尾甲黄素A、野鸢尾黄素和止咳药效成分次野鸢尾黄素、白射干素的含量测定结果,通过单因素方差分析得到不同产地射干药材药效成分含量存在显著性差异;在33批药材中,抗炎药效成分含量以四川阿坝州射干为最高(83.31mg.g-1),其次是海南昌化射干(48.73mg.g-1)和湖南长沙射干(41.38mg.g-1),陕西商洛射干最低(10.47mg.g-1),最高者与最低者相差近5倍;止咳药效成分含量以河南南阳射干最高(2.010mg.g-1～3.540mg.g-1),其次是贵州黔西射干(2.190mg.g-1～2.476mg.g-1)和湖北黄冈射干(1.644mg.g-1～2.714mg.g-1),四川阿坝州射干最低(0.2235mg.g-1),最高者与最低者相差近17倍。以不同产地射干中10种药效成分含量为原始数据对33批样品进行系统聚类,共聚为两类,同一产地药材被聚在同一类,其中海南昌化、四川成都、四川阿坝州、湖南长沙、湖北黄冈射干抗炎药效成分含量相对较高(28.32mg.g-1～83.31mg.g-1)且在总成分中的占比也相对较高（93.82%～99.73%）被聚为Ⅰ类;贵州黔西、湖北恩施、河南南阳、安徽亳州、陕西商洛、河北安国、辽宁沈阳射干止咳药效成分含量相对较高(0.9053mg.g-1～3.540mg.g-1)且在总成分中的占比也相对高（4.48%～15.13%）被聚为Ⅱ类。通过对不同年均气温、年均降水量及年均日照时数下的射干药效成分含量对比分析可知,日照时数可能对抗炎药效成分含量有影响,降水量可能对止咳药效成分含量有影响,而气温对药效成分含量并无确切影响。通过对比同产地不同月份采收的射干药效成分含量可知,抗炎药效成分含量秋季采收期高于春季采收期且呈现动态变化,9月至翌年3月逐渐下降至最低后逐渐回升,4月达到含量峰值后又逐渐回落;止咳药效成分含量变化幅度并不明显,从9月至翌年5月大致呈现先降后升再降的变化趋势;苷类药效成分含量在秋季变化幅度并不明显,但含量整体高于翌年春季,翌年3月起出现回升,4月又逐渐回落;苷元类药效成分含量在秋季变化幅度也不明显,自翌年3月起含量逐渐上升后趋于稳定。通过对比同产地不同生长年限的射干药效成分含量可知,随着射干生长年限的增加,抗炎药效成分含量变化幅度明显,呈先增加后下降的趋势,以3年生射干含量为最高;止咳药效成分含量于药材生长至两年后趋于平稳;苷类药效成分含量同样呈先增加后下降的趋势,以3年生射干含量最高;苷元类药效成分含量呈现逐渐上升趋势,但幅度变化并不明显。4基于最佳配比的射干初步评价研究结果通过对比,共有来自不同产地的12批射干接近止咳最佳配比。结论:1根据《国家药品标准物质技术规范》相关规定,实验室自制的三种化学对照品鸢尾黄素、野鸢尾黄素、白射干素经鉴定为单一纯物质,含量均达到98%以上,符合含量测定用化学对照品纯度要求,可以用于含量测定。2依据本草考证、现代文献、网络查阅及调研,综合地理位置、气候、海拔等因素从我国七大区域中选出的12个药材产地并按照药材不同的采收时间、生长年限选择的33批实验药材样本具有一定代表性,但由于疫情原因,原计划在前期研究基础上,对药材进行2～3年现场多地块采集无法如期进行,造成实验样本量过小,可能给实验结果带来误差。3对不同产地射干药效成分含量进行单因素方差分析得到,不同产地药材药效成分含量存在显著性差异。进一步聚类发现,生长在102°19′E～114°7′E,28°54′N～31°54′N的西南-华中区域范围内的四川阿坝州、海南昌化、湖南长沙、湖北黄冈、四川成都射干药材抗炎药效成分含量较高,推测温暖、湿润的气候条件可能利于抗炎药效成分的积累;生长于海拔2600米以上高原地区的射干抗炎药效成分含量最高,推测充足的光照可能利于抗炎药效成分的积累;生长于104°15′E～120°21′E,32°18′N～34°05′N的秦岭一带的射干止咳药效成分含量较高,推测南北过渡性气候可能更有利于止咳药效成分的积累;生长在山地区域内的药材止咳药效成分含量相对较高,推测降雨量可能对止咳药效成分有影响;生长于38°～42°中纬度平原地区的药材抗炎、止咳药效成分含量均偏低,推测低温可能不利于药材生长。综上,初步认为射干药效成分具有一定的地理、气候相关性。4对同产地射干药效成分含量研究表明,日照时数可能会影响抗炎药效成分,降水量可能主要对止咳药效成分有影响,而气温与药效成分含量的相关性并不大,但由于分析样本量过小,具体影响趋势还需进一步深入研究。5通过对不同采收时间、不同生长年限的射干对比分析发现,药效成分含量的变化与药材生长期密切相关,河南南阳射干最佳采收时间大致为秋季采收期或春季4月份,贵州黔西射干最佳采收年限大致为3年,但因不同产地药材生长期受到气候、温度等诸多因素影响存在一定差异,具体情况还应结合区域因素、气候因素、地理因素等进一步研究分析。6通过将12个产地33批射干药效成分含量与止咳最佳配比对比分析可知,海南昌化、贵州黔西、湖北黄冈、河南南阳、安徽亳州、陕西商洛、河北安国的射干比较接近最佳配比,因药材产地多分布在秦岭一带,考虑将这一区域划分为治疗咳嗽疾病首选射干药材的生长区域。7本专题以射干中药效成分含量为考察指标对不同产地药材进行评价,初步认为药效成分含量具有产地差异性且功效偏重有所不同,为确保临床疗效均一性应将产地因素列为考虑范围内。