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研究目的:端粒的稳定对肿瘤的发生发展至关重要,人类端粒是由重复TTAGGG序列和与之结合的被称为shelterin的六蛋白复合物组成,该复合物在维持和保护端粒方面起关键作用。端粒shelterin复合物包含TRF1、TRF2、POT1、TIN2、TPP1和RAP1。其中,TPP1通过与TIN2和POT1结合将端粒双链区和端粒单链区联系在一起,使端粒形成一完整整体。此外,TPP1还能与端粒酶结合并招募其到染色体末端合成端粒DNA。TPP1端粒酶结合结构域突变的突变体丧失了延长端粒的功能,肿瘤细胞生长受到抑制,抑制端粒酶的端粒募集代表了一种新的靶向端粒的抗肿瘤策略。尽管在过去的十几年期间,研究者们已经阐明了TPP1端粒调控上的生物学功能,但是靶向抑制TPP1介导的端粒酶端粒募集通路在抗肿瘤治疗中的意义并不是十分明确。我们拟通过过表达TPP1端粒酶结合结构域多肽竞争性抑制TPP1和端粒酶结合来揭示阻断TPP1介导的端粒酶端粒募集通路在非小细胞肺癌治疗中的意义,为靶向端粒的抗肿瘤治疗提供潜在新策略。研究方法:TPP1作为端粒保护蛋白之一,可通过其OB结构域(TPP1端粒酶结合结构域)与端粒酶催化亚基TERT结合,募集端粒酶到端粒末端合成端粒DNA。本课题采用过表达TPP1-OB结构域的方式,竞争性抑制细胞内源性TPP1-TERT相互作用,进而阻断端粒酶被招募至染色体末端进行端粒合成,但不干扰TPP1端粒保护功能,来研究这种靶向策略对肺癌细胞体内外生长的抑制作用。首先通过免疫共沉淀实验,验证外源性过表达TPP1-OB可以抑制细胞内源性TPP1与TERT的结合。然后构建可以稳定过表达TPP1-OB的肺癌细胞系,通过细胞短期增殖实验、细胞长期增殖实验、药物敏感性实验和平板克隆实验验证,过表达TPP1-OB对细胞的增殖、克隆形成能力及细胞对化疗药物的敏感性变化的情况,进一步通过细胞衰老和凋亡检测以及细胞周期分析研究TPP1-OB对细胞衰老、凋亡或细胞周期的影响,通过软琼脂集落形成实验和裸鼠移植瘤模型检测TPP1-OB对细胞集落形成能力和肿瘤体内生长的影响。研究结果:过表达TPP1-OB可以竞争性抑制细胞内源性TPP1与TERT的结合使端粒酶无法到达端粒末端,从而阻断细胞内端粒酶端粒募集通路。在非小细胞肺癌细胞系中,过表达TPP1-OB通过缩短端粒长度造成细胞的长期增殖能力下降、平板克隆形成能力下降,TPP1-OB抑制细胞增殖主要是通过端粒缩短诱导的细胞周期G1期阻滞和凋亡增加。软琼脂集落形成实验表明TPP1-OB能够抑制肺癌细胞集落形成能力。体内实验证实TPP1-OB也能够抑制肺癌细胞体内生长。我们还发现TPP1-OB能够增强肺癌细胞对化疗药物紫杉醇的敏感性。研究结论:我们的研究表明通过过表达TPP1-OB蛋白抑制TPP1介导的端粒酶端粒募集通路可以作为一种靶向端粒抗肺癌治疗的潜在新策略。