【研究背景】缺血性脑卒中（Cerebral ischemia stroke）,是神经系统最为常见的急重症之一,是指各种脑血管先天发育异常以及后天因素（高血压、高脂血症、糖尿病等）引起的脑血管管腔狭窄、闭塞或堵塞,从而导致局部或全脑脑血流灌注锐减或中断而引发的一种疾病。缺血性脑卒中其发病率、致残率及致死率均高,严重威胁我国人民健康及生活质量。随着医学的发展,缺血再灌注治疗（包括急性溶栓、介入取栓或支架置入及血管搭桥等）在临床得到广泛应用,也取得较好的疗效。然而,在获得缺血再灌注治疗益处的同时,其也可引起明显的脑缺血再灌注损伤,严重影响治疗效果。研究发现,多种致伤机制均参与其中,如钙超载、兴奋性毒性、氧化应激及内质网应激等。已有大量研究旨在阐明脑缺血再灌注损伤的致伤机制及寻找其潜在的干预靶点,然而,目前情形并不容乐观。容量性钙内流（Capacity calcium entry,CCE）是细胞内钙动态平衡的重要调节机制,通过感应内质网内钙浓度,调控CCE复合体形成,介导外钙内流,补充细胞内及钙库内钙。CCE复合体主要由钙浓度感应分子——基质相互作用分子（Stromal interaction molecule,STIM）、钙释放激活的钙通道(Ca²⁺release-activated Ca²⁺channels,CRACs)及相关调节蛋白构成。氧化应激、钙库排空及细胞酸化等因素可激活CCE,形成CCE复合体,调控神经元存活,参与急、慢性神经系统疾病的发生与发展。如前所述,氧化应激、钙超载等均参与脑缺血再灌注损伤,那么CCE是否在其中发挥作用,及其具体机制如何,目前尚不可知。【研究目的】本研究旨在:（1）明确脑缺血再灌注损伤中,CCE主要构成分子时空变化规律及其作用;（2）探讨调控CCE所介导的神经保护机制;（3）寻找潜在的CCE内源性调控分子,为脑缺血再灌注损伤治疗提供新的思路或潜在的干预靶点。【研究方法】1、采用原代海马神经元氧糖剥夺再灌注（Oxygen-glucose deprivation&reperfusion,OGD/Rep.）模型体外模拟脑缺血再灌注损伤;采用谷氨酸诱导的HT-22细胞系氧化应激模型研究Homer1a与CCE间相互作用关系;2、采用实时定量PCR技术及蛋白免疫印迹（Western Blot,WB）检测OGD/Rep.处理后CCE构成分子、凋亡及自噬相关分子的mRNA及蛋白水平改变;3、采用乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）释放量检测评价神经元损伤情况,采用原位末端标记（Terminal dUTP nick end labelling,TUNEL）方法检测神经元凋亡改变;4、采用转染STIM1、STIM2及内质网等荧光蛋白标记质粒及免疫荧光染色技术可视化CCE构成分子空间定位变化;5、采用慢病毒介导的短发卡RNA（short hairpin RNA,shRNA）及CRISPR/Cas9技术调控神经元STIM1、STIM2及Homer1a表达水平;6、采用转染LC3-GFP及mRFP-GFP-LC3荧光蛋白标记质粒可视化神经元自噬及自噬流改变;7、采用CCE、钙调素依赖的蛋白激酶II（Calmodulin-Dependent Protein Kinase II,CaMKII）及自噬药物抑制剂或激动剂调控其活性;8、采用Fluo-4 AM、Fura-red AM及胞浆钙荧光指示蛋白监测CCE介导的钙内流及胞浆内钙水平改变;9、采用蛋白质免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,co-IP）技术检测蛋白分子间相互作用。【研究结果】第一部分研究发现:OGD/Rep.处理后,CCE主要构成分子,包括STIM1、STIM2、Orai1、Orai2及TRPC1 mRNA及蛋白水平均无明显改变,然而,胞浆内STIM1斑块数明显增加;抑制CCE可明显减轻OGD/Rep.引起的神经元细胞内钙超载;下调或敲除STIM1表达或应用CCE药物抑制剂均可明显减轻OGD/Rep.诱导的神经元损伤,抑制其凋亡,促进神经元存活。本部分研究表明,CCE参与OGD/Rep.介导的神经元损伤的致伤机制,抑制CCE可发挥神经保护作用。第二部分研究发现:OGD/Rep.处理后,神经元自噬水平增加,但同时也存在一定程度的自噬降解受阻;药物激动剂激活自噬可减轻OGD/Rep.介导的神经元损伤;CCE抑制可发挥类似自噬激动剂的作用,在激活神经元自噬的同时,并一定程度改善自噬降解受阻;进一步研究发现,OGD/Rep.处理后,CaMKII磷酸化水平明显增加,而抑制CaMKII活性可明显下调雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin,mTOR）磷酸化水平,促进自噬激活,减轻神经元损伤;抑制CCE后,CaMKII及mTOR磷酸化水平均明显下降,且CCE抑制及mTOR抑制所介导的神经保护作用并无明显叠加效应。本部分研究表明,抑制CCE可一方面通过抑制CaMKII-mTOR信号,促进自噬形成,同时另一方面也可改善自噬降解受阻,发挥神经保护作用。第三部分研究旨在寻找CCE潜在的内源性负性调控分子,为排除离子型谷氨酸受体的影响,特采用谷氨酸诱导的HT-22细胞系氧化应激模型,研究发现:氧化应激损伤后,STIM1及Orai1蛋白水平无明显改变,而STIM1胞浆内斑块数明显增加,并逐渐向细胞膜靠近;下调或敲除STIM1表达或采用CCE药物抑制剂均可减轻神经元氧化应激损伤;上调Homer1a表达则可明显抑制CCE所介导的钙内流、氧化应激所引起的晚期细胞内钙超载及线粒体氧化应激损伤,发挥类似CCE抑制所介导的神经保护作用;此外,co-IP发现STIM1、Homer1a及Orai1间存在明显蛋白相互作用,上调Homer1a蛋白表达可明显抑制谷氨酸引起的STIM1-Orai1复合体形成。以上实验结果表明,抑制CCE可减轻神经元氧化应激损伤,而Homer1a可通过抑制STIM1-Orai1复合体形成负性调控CCE,发挥神经保护作用。【研究结论】本研究首先证实,CCE参与脑缺血再灌注损伤的致伤机制,抑制CCE可发挥神经保护作用;该神经保护作用其机制可能与促进自噬发生、改善自噬降解障碍及抑制凋亡有关;此外,本研究还发现一种CCE内源性负性调控分子——Homer1a,其可通过负性竞争抑制STIM1-Orai1复合体形成,抑制CCE,介导神经保护作用。以上研究进一步揭示了脑缺血再灌注损伤的致伤机制,也发现了该致伤机制的内源性调控分子,为缺血性脑卒中的治疗提供了新的切入点及干预靶点。