论文部分内容阅读
乙型肝炎病毒(hapatitis B virus,HBV)属于嗜肝病毒科,是部分闭合环状DNA病毒,全长约3.2kb。HBV感染会引发急性肝炎、慢性肝炎、乙型肝炎肝硬化和肝细胞癌的发生,严重威胁人类健康。HBV是感染人类最成功的病原体之一,据报道全世界大约有4亿人已感染乙型肝炎病毒,其中,75%以上居住在太平洋西部及东南亚地区,中国是一个乙肝大国,约有1.2亿患者。研究发现,大约15%～40%的乙肝病毒携带者最终发展为与HBV相关的肝硬化或肝癌,每年约有60万的人死于HBV感染导致的肝病。目前国内外医学界所公认有效的HBV抗病毒药物主要有两大类:核苷类似物(Nucleoside analogues,NA)和α干扰素(alpha interferon,IFN-α),大量研究表明,NA长期治疗后易发生耐药突变,且停药后易出现病毒反跳,引发肝功能异常。IFN-α既能够抑制病毒粒子复制,又可提高宿主免疫应答能力,阻止病毒侵袭,清除HBV感染的细胞。然而,IFN-α的抗病毒作用具有明显的病毒基因型依赖性,不同基因型对该药物应答效率有差异性,研究提示HBV基因型B的应答效率优于C基因型,那么,I基因型对IFN-α的应答效率如何,迄今为止未见相关报道。本研究利用真核高效表达载体pcDNA3.1(+)及HBV不同基因型的全基因组序列构建重组质粒,用脂质体介导转染HepG2(Human hepatocellular liver carcinomacellline2)细胞系,用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测乙肝表面抗原的表达;用MTS比色法检测IFN-α对瞬时转染1倍HBV重组质粒的HepG2细胞的毒性作用,用ELISA检测HBsAg表达量以评估IFN-α的抗病毒效果。本研究成功构建B、C、I基因型的pcDNA3.1(+)/HBV重组质粒;重组质粒成功转染HepG2细胞,上清中检测到HBsAg表达;B、C基因型重组质粒对HepG2细胞生长抑制作用不显著,Ⅰ型重组质粒对HepG2细胞生长有抑制作用;α-lb对瞬时转染1倍HBV的HepG2细胞生长抑制作用不明显;瞬时转染1倍B、C和Ⅰ型的HepG2细胞对8000IU/ml的α-1b干扰素的应答效率优于其他浓度组;α-1b对瞬时转染1倍B型HepG2具有持续应答效应;瞬时转染1倍Ⅰ型HepG2有短暂的前期应答效应,且HBsAg短暂的下降后又有升高的趋势;瞬时转染1倍C型HepG2有前期应答效应,但不稳定、易波动。通过美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库检索1148条中国地区的HBV序列(统计信息包括基因型、分布地区、临床症状)。HBV基因型的分类通过直接参考NCBI注释、进化树分 析和网 站分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi);MEGA5.0软件用邻近法构建进化树,HBV序列的分组依据进化树分支和组间计算法计算的遗传距离;712条有明确临床症状的HBV序列,用DNAStar和BioEdit软件包分析BCP/pre-C突变与临床症状的相关性;RNAdraw软件分析密码子的偏嗜性及RNA的二级结构,基因组的重组分析用Simplot软件。在中国,东北、华北地区主要以C型为主,中南地区以B型为主,西南地区以B、C基因型为主,西北地区以C/D重组型为主,B2和C2是两个主要亚型;FJ386674可能是假设的B10亚型;BCP区双突变及前C突变在不同临床症状中有显著差异;除ATG外,可能有其他起始密码子的存在;乙肝病毒基因组有密码子偏嗜性,X、C和P阅读框的终止密码子分别是TAA、TAG和TGA,B2和C2亚型S-ORF的主要终止密码子分别是TAA(96.45%)和TGA(83.60%)。本研究提示8000IU/ml的α-1b对HBV B、C和I基因型病毒有较好的抑制作用。此外,本文概述了中国地区HBV的流行病学,这些信息可能对未来预防和治疗HBV感染有重要作用。