可得然胶是一种水不溶性β-D-1,3-葡聚糖，具有加热成胶特性，在食品、生物医药等领域具有广阔的应用前景。可得然胶是土壤杆菌（Agrobacterium sp.）等细菌在氮源缺乏的条件下产生的一种细菌胞外多糖。对于可得然胶的合成机制已有了一定的认识，研究发现，可得然胶由底物UDP-葡萄糖经可得然胶合酶催化合成，编码可得然胶合酶的基因是crdASC，同时受转录因子crdR的正向调控。但是，对于土壤杆菌调控可得然胶合成的分子机制还研究较少，对于调控可得然胶合成的代谢网络还不太清楚 。
　　本文首先构建了土壤杆菌DH29转座子突变文库，以期通过转座子突变文库筛选来寻找与可得然胶合成相关的基因。当大肠杆菌 SM10 λpir/pSC189 菌株与土壤杆菌DH29按1:1体积比混合后进行固体接合时接合效率最高，可达到8‰。采用上述优化后的接合方法构建了包含3072株突变菌株的转座子突变文库。为了检测转座子突变文库的质量，随机挑取10个转座子突变菌株进行了插入突变基因的确定，结果显示有5个突变子插入到了不同的基因内，结果说明了转座子突变文库具有较好的基因插入突变的随机性，可以用于后续的筛选实验。
　　随后，本文通过48孔板发酵初筛和摇瓶发酵复筛，对突变体库中1056株菌进行筛选，得到了11株可得然胶产量较野生株降低50%的突变子。通过分析11株突变子的突变基因和基因功能，最终选择3个和能量以及氮代谢相关基因thiG、phbC和glnA进一步对其影响可得然胶产量的机制进行研究。thiG、phbC和glnA 3株基因突变株可得然胶粗产量显著低于野生株产量，粗产量较野生株分别降低约84%、89%和90%。通过分析基因功能，发现thiG、phbC和glnA基因分别编码维生素B1、(R)-3-羟基丁酸甲酯和谷氨酰胺合成酶基因，因此通过添加上述产物来验证是否可以恢复突变株的可得然胶产量。结果发现，随着维生素B1添加浓度逐渐升高，可得然胶粗产量逐步提高，当添加50mg/mL维生素B1时，可得然胶粗产量可以达到与野生株相当的42.07g/L，表明添加适量维生素B1可以回复 thiG 基因突变菌株的可得然胶产量。但是，添加谷氨酰胺和 (R)-3-羟基丁酸甲酯并不能恢复glnA和phbC基因突变菌株可得然胶产量，说明glnA和phbC基因在可得然胶合成相关代谢网络中具有更为复杂的调控功能。
　　为了进一步分析 phbC 和 glnA 基因在可得然胶合成中的调控作用，本文构建了phbC和glnA基因无缝敲除菌株及其回补菌株。结果显示ΔphbC菌株产量约24g/L，相对于野生株降低了45%；ΔglnA菌株产量约4g/L，相对于野生株降低了88.23%。phbC基因回补菌株产量和基因敲除菌株无差异，glnA基因回补菌株产量为 35.63g/L，是敲除菌株产量的 8.9 倍，产量恢复到野生株产量的 90%。随后通过荧光定量PCR分析phbC和glnA基因是否影响了可得然胶合成相关基因的表达。实验结果显示，在发酵12h的产胶期，与野生株相比，ΔphbC和ΔglnA菌株的可得然胶调控基因crdR和可得然胶合成酶基因crdS表达量都发生了明显下调，说明ΔphbC和ΔglnA菌株都影响了可得然胶合成相关基因crdR和crdS的表达，从而引起了产量降低。另外，在ΔglnA菌株中，galU基因表达量也发生了下调，而 galU 基因作为底物 UDP-葡萄糖的合成基因对可得然胶合成具有重要作用。
　　最后本文分析了敲除株产生的可得然胶在凝胶性质上的变化，由于ΔglnA菌株凝胶产量太低，无法提取出凝胶而未作性质分析。ΔphbC菌株所产可得然胶凝胶强度为812.521g/cm2，相对于菌株DH29所产可得然胶凝胶，其凝胶强度降低了21%。红外光谱结果表明，ΔphbC所产可得然胶与野生株所产的可得然胶结构一致。
　　综上所述，本文构建了土壤杆菌DH29转座子突变文库，通过高通量筛选获得与可得然胶合成相关的11个基因。进一步分析phbC和glnA基因在可得然胶合成中的调控作用，发现ΔphbC和ΔglnA菌株影响了的可得然胶合成相关基因crdR和crdS的表达引起了产量降低。另外，在ΔglnA菌株中，底物UDP-葡萄糖的合成基因galU基因表达量也发生了下调，初步发现了ΔphbC和ΔglnA菌株引起产量降低的原因。最后，通过 ΔphbC 菌株所产可得然胶的性质分析发现凝胶强度有所降低，可得然胶结构并没有明显不同。通过本课题的开展找到了新的可得然胶合成关联基因，为系统全面了解土壤杆菌可得然胶合成的分子机制奠定一定的理论基础，为通过代谢改造提高可得然胶产量提供理论支持。