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本研究旨在探索基于骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)体外构建预血管化膜片,细胞外基质(extracellular matrix,ECM)微环境对血管化网络结构形成的影响,以期为优化构建预血管化的组织提供理论指导。方法:(1)BMSCs膜片的构建:hBMSCs以高密度播种,分别在干细胞培养介质和成骨诱导培养介质中连续培养14d,经大体观、显微镜、组织学方法检测获得膜片的特征。(2)不同内皮细胞接种密度对血管网形成的影响:hBMSCs高密度接种并连续培养14d形成未分化hBMSCs膜片,人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)以不同密度播种至该膜片上继续培养7d。镜下观察细胞形貌、血管网形成,行CD31免疫荧光检测。(3)不同膜片基质微环境对血管网形成的影响:hBMSCs高密度接种后分别诱导培养形成成骨分化膜片(osteogenic differentiated sheet,OS)和未分化膜片(undifferentiated sheet,US),HUVECs以相同密度播种至上述两组膜片上继续培养。3d、7d时分别行Ⅰ型胶原(collagenⅠ,ColⅠ)、纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)、CD31免疫荧光检测,镜下观察血管网形成情况。结果:(1)经连续培养可获得完整的hBMSCs膜片,hBMSCs经成骨诱导后还能快速增殖,所得膜片茜素红和碱性磷酸酶染色呈阳性。(2)HUVECs接种在hBMSCs膜片上逐渐重排,CD31染色显示进行性管腔的形成。低密度时形成血管网较少,随密度增大,形成的血管网增多,当HUVECs接种密度达5×104cell/cm2时,即使再增大其密度,形成的血管网也不再增多。(3)OS和US膜片ColⅠ和FN染色均呈阳性,定量显示OS中ColⅠ的相对含量明显高于US。接种HUVECs后两组膜片中的ColⅠ排列更加规则有序,出现管腔状空隙,其相对含量亦逐渐降低,OS组变化更加明显。两组膜片FN均未见明显变化。定量显示在3d和7d时OS组的血管化网络结构数目均高于US组。结论:(1)经简单连续培养可获得BMSCs膜片,经成骨诱导后可形成具有成骨特性的BMSCs膜片。(2)通过将HUVECs培养在未分化BMSCs膜片上,可体外构建预血管化细胞膜片;在本实验条件下,当内皮细胞的接种密度达到5×104cell/cm2时是形成预血管化网络结构的最佳接种密度。(3)在内皮血管网形成过程中膜片ECM发生改建,且OS可以明显促进内皮血管网的形成。