酰胺酶可以将酰胺水解生成对应的羧酸和氨，在医药、食品、纺织皮革加工等方面具有极其重要的作用。L-天冬酰胺酶广泛被临床上用于儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）的治疗；L-谷氨酰胺酶在谷氨酰胺分解过程中是关键酶和限速酶，与肿瘤的生长、肿瘤血管的生成及肿瘤免疫都有重要的关系；立体专一性哌嗪-2-甲酰胺酶可以催化水解产生一种手性药物中间体哌嗪-2-羧酸，其不同的单一对映体（R型和S型）衍生物具有多种不同的药理学活性。本实验室在前期工作中筛选得到的马氏副球菌(Paracoccus marcusii)W10173可立体选择性水解(R,S)-哌嗪-2-甲酰胺中的(S)-哌嗪-2-甲酰胺得到(S)-哌嗪-2-羧酸，本实验通过基因组测序技术获得马氏副球菌W10173基因组，为了进一步发掘菌株本身酰胺酶资源，分析得到5个酰胺酶基因并对其进行克隆及异源表达，为酰胺酶的生产和应用提供基础。　　本研究主要内容包括：⑴通过分析基因组测序，马氏副球菌W10173编码1个谷氨酰胺酶(PM1509)、2个天冬酰胺酶(PM1383, PM3012)和2个潜在的哌嗪-2-甲酰胺酶(PM2486, PM3475)。PM1509, PM1383和PM3012成功克隆并构建pET28-a(+)-X/BL21(DE3)原核重组表达载体，以IPTG为诱导剂，当OD600约为0.6时，加入0.8 mmol/L IPTG，18℃诱导5 h，目的蛋白的表达量分别占蛋白表达总量的30.5％,23.8%,20.3%。但目的蛋白都以包涵体形式存在，经超声破碎处理后将包涵体蛋白用Ni柱试剂盒纯化，纯化后蛋白的表达量分别为2.53 mg/mL,2.13 mg/mL,1.62 mg/mL，纯化蛋白复性后蛋白的表达量分别为0.41 mg/mL,0.34 mg/mL,0.31 mg/mL，收率分别为16.2%,15.9%,19.1%。分别以L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺为底物采用TLC法测定复性后的酶蛋白活性，催化水解可以得到相应的产物，证明PM1509表达的蛋白有L-谷氨酰胺酶酶活，PM1383和PM3012表达的蛋白有L-天冬酰胺酶活性。⑵利用SOMPA软件、PredictProtein数据库对PM2486和PM3475基因进行编码蛋白的二级结构组成预测，结果显示β-折叠较少，而无规则卷曲较多且含有半胱氨酸可形成二硫键，这些因素导致了复性后的蛋白无活性的可能性较大，故选取巴斯德毕赤酵母GS115进行真核表达。筛选得到的转化子经过验证大多数为甲醇利用快型，以甲醇为诱导剂诱导蛋白表达，重组菌甲醇诱导表达后SDS-PAGE检测目的蛋白得到表达，发酵液上清和菌体中都有蛋白表达，以哌嗪-2-甲酰胺为底物进行酶活测定，结果显示PM2486表达的蛋白在发酵液上清和菌体中且都有活性，而PM3475表达的蛋白没有活性。对初筛发酵液上清所含蛋白含量较高的转化子PM2486-5进行诱导表达，通过对每天样品的检测可知随着诱导时间的延长，蛋白表达量在增加，Bradford法测定PM2486-5诱导表达6 d后发酵液上清蛋白含量为0.519mg/mL。