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无锡他汀作为本实验室拥有自主知识产权的一种新型羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，由洛伐他汀经拟无枝酸菌Amycolatopsis sp. CGMCC1149转化而来，是一种潜在的高效降血脂药物，其中羟基化酶是催化洛伐他汀羟基化的关键限速酶。本研究运用简并PCR和SEFAPCR从Amycolatopsis sp. CGMCC1149基因组中克隆获得羟基化酶全新基因并实现其在大肠杆菌中表达，同时初步建立了洛伐他汀体外催化系统，该系统的建立为进一步实现无锡他汀大规模制备奠定基础。前期研究运用简并PCR已获得羟基化酶基因保守区片段，在此基础上，结合SEFAPCR克隆获得羟基化酶基因全序列，共计1209bp，可编码403个氨基酸的蛋白，其分子量为44.8kDa。生物信息学分析显示：该基因为一个新的羟基化酶基因，属于细胞色素P450基因超家族CYP105家族，其中与Amycolatopsis azurea的P450Um-1亲缘关系最近；此酶包含氧结合区、离子对结合区及血红素结合区等细胞色素P450典型功能区。同时，利用蛋白同源建模技术得到羟基化酶的3D模型，该模型包含12个α螺旋和4个β折叠，大致分为α螺旋集中区和β折叠集中区，其中αFG与BC loop组成底物进入通道。另外，该基因密码子使用呈现一定偏好性，密码子第三位碱基G、C使用频率比较高。为建立洛伐他汀体外催化系统，构建了一株羟基化酶重组菌E. coli DH5α(pEtac-p450lov)。该菌质粒稳定性良好，传代60次后，质粒稳定性为92%。CO示差光谱显示在450nm附近有特征吸收峰，表明羟基化酶正确表达，并以活性形式存在。同时对重组菌E. coli DH5α (pEtac-p450lov)的表达条件进行优化，其最适条件为：当菌体培养至OD600为0.6，加入0.1mM IPTG进行诱导，20°C继续培养8h时羟基化酶表达量最高，培养基中添加0.5mg/L FeCl2可增加羟基化酶表达量。为实现洛伐他汀的体外催化，分别考查了利用3种不同来源电子传递系统建立的洛伐他汀体外催化系统。结果显示，以E. coli电子传递系统建立的体外催化系统无法催化洛伐他汀羟基化；以Amycolatopsis sp. CGMCC1149电子传递系统建立的系统可以催化洛伐他汀羟基化，但其催化效率较低；而以铁氧还蛋白及铁氧还蛋白还原酶为电子传递系统所建立的系统可以实现洛伐他汀体外催化且催化效率最高。因此，选择以铁氧还蛋白及铁氧还蛋白还原酶建立的体外催化系统作为进一步研究对象，对其反应条件进行优化，其最适反应条件为：温度30°C，最适pH7.5，反应时间6h，NADH600μM，底物浓度30μM。