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第一部分β-catenin siRNA对骨肉瘤MG63细胞生长,凋亡的影响目的设计针对β-catenin基因CTNNB1的特异性RNA干扰序列,转染人骨肉瘤MG63细胞系,观察其对目的基因P-catenin表达的影响,研究β-catenin基因下调后对骨肉瘤细胞生长和凋亡的影响。方法根据GenBank提供的CTNNB1基因序列和NCBI上probe的记载找到一条P-catenin的RNA干扰序列,交由公司合成该序列,并转染骨肉瘤细胞。利用RealtimePCR检测RNA干扰在mRNA水平上的效果,Western印迹法在蛋白水平上检测beta-catenin的表达。Annexin V-FITC/PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡。CCK-8法检测细胞增殖。结果设计beta-catenin siRNA,并可以显著下调人骨肉瘤MG-63细胞beta-catenin mRNA和蛋白的表达,CCK-8法检测细胞增殖没有显著差异,流式细胞检测也没有明显的凋亡增加。结论成功构建了针对CTNNB1基因的特异性siRNA,转染细胞后可抑制beta-catenin基因表达,但对肿瘤细胞生长和凋亡没有影响。第二部分β-catenin siRNA对骨肉瘤MG63细胞侵袭的影响及机制研究目的研究RNA干扰β-catenin基因表达后对人骨肉瘤MG63细胞系侵袭的影响和可能产生的机制。方法应用Lipofectamine TM2000转染针对β-catenin的特异siRNA进入MG-63细胞内,transwell法检测细胞侵袭和迁移能力,Western blot检测Wnt靶基因MT1-MMP的蛋白表达。结果transwell法迁移实验结果显示实验组较对照组迁移细胞减少,侵袭实验也显示跨过基质胶细胞减少,两组间有显著差异。MT1-MMP蛋白表达也降低。结论β-catenin siRNA可以有效抑制骨肉瘤MG63细胞的侵袭,可能是通过抑制MT1-MMP的表达而达到的。第三部分β-catenin siRNA对骨肉瘤MG63细胞耐肿瘤药物的影响及机制研究目的探讨siRNA抑制骨肉瘤细胞MG63细胞系β-catenin的表达对多柔比星耐药性的影响,及其产生的机制。方法Annexin V-FITC/PI染色流式细胞仪检测细胞在多柔比星条件下的凋亡情况。CCK-8法检测在不同浓度多柔比星处理后的细胞活性。应用Realtime PCR法检测NF-kappaB靶基因XIAP和Bclxl的mRNA表达,Western blot法检测p65,XIAP和Bclxl蛋白表达。结果流式细胞仪检测结果显示实验组凋亡率较阴性对照组和空白对照组明显降低p<0.01。CCK-8法检测实验组细胞活性明显增加p<0.01。实验组XIAP和Bclxl的mRNA表达增加,p65,XIAP和Bclxl蛋白表达,较阴性对照组和空白对照比较具有差异性,p<0.01。结论在骨肉瘤MG63细胞中干扰β-catenin的表达可以促进肿瘤细胞对多柔比星的耐药性,这种耐药性可能是通过NF-kappaB途径产生的。