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目的：
结直肠癌是世界范围内最常发生的恶性肿瘤之一,在我国其发病率和死亡率逐年升高,目前死亡率已跃居恶性肿瘤第2位。尽管确诊时70-80%的患者可以进行根治性手术切除,但总体的5年生存率仍只有50-60%。约2/3接受过根治手术的患者发生复发或远处转移,常见的转移部位有:肝脏、肺、骨、脑、肾上腺,为血行转移所致。因此,全身化疗既是早中期结直肠癌术后辅助治疗的主要手段,也是晚期结直肠癌姑息治疗的主要手段。近年来,随着肿瘤分子生物学研究的深入,为肿瘤的药物治疗提供了分子靶向治疗这种新模式。分子靶向治疗制剂因其高效低毒的特性,越来越引起临床医师的重视,目前的研究大多集中在与细胞生长、分化和凋亡调控机制相关的信号传导途径。
c-Cbl和Cbl-b是Cbl(CasitasB-lineagelymphoma)家族的重要成员,Cbl是在进化上相对保守的一类广泛分布的细胞内蛋白,Cbl蛋白中含有多个不同的结构域,在细胞的活化过程中可作为接头蛋白或支架蛋白参与信号转导;同时由于Cbl中包含N-端保守的TKB和RING结构域,使Cbl成为泛素连接酶E3家族(RING型E3)重要的一员。通过TKB及其他结构域识别并结合靶蛋白,RING结构域募集泛素结合酶E2,从而启动泛素化降解途径。参与细胞内信号转导的负向调控,这对于维持细胞的内稳态具有重要作用。
c-Cbl、Cbl-b在结直肠癌中的表达,及其与临床病理因素和生存的相关性研究在国内外报道较少。
本研究构建了结直肠癌组织芯片,应用免疫组化SP法,检测c-Cbl和Cbl-b蛋白在结直肠癌中的表达情况,并分析其与结直肠癌临床病理特征的关系以及对生存的影响,旨在探讨c-Cbl和Cbl-b在结直肠癌组织中的表达及其临床意义。
材料和方法：
一、组织标本
中国医科大学附属第一医院和辽宁省肿瘤医院2005年8月至2006年6月手术切除的结直肠癌组织标本128例,术前未行放疗、化疗及免疫治疗。其中男性74例,女性54例。年龄31岁～81岁,中位年龄55岁。病理类型均为腺癌(有5例无法评价分化程度),分为低级别结直肠癌和高级别结直肠癌2组,其中低级别组包括:高分化(管状)腺癌,中分化(管状)腺癌,乳头状腺癌,共108例:高级别组包括:低分化(管状)腺癌,粘液腺癌,共15例。结直肠癌分期采用美国癌症联合委员会(AJCC)第6版分期标准,其中T1为2例,T2为19例,T3为89例,T4为18例;发生淋巴结转移46例;发生远处转移5例;Ⅰ期患者14例,Ⅱ期患者67例,Ⅲ期患者42例,Ⅳ期患者5例。
二、试剂
鼠抗人c-Cbl单克隆抗体购自BD公司;鼠抗人Cbl-b单克隆抗体购自SANTACRUZ公司;SP检测试剂盒及DAB显色液均购自福州迈新生物技术开发有限公司。
三、方法
将128例结直肠癌标本制作成组织芯片,采用免疫组化SP法,按照SP检测试剂盒说明书所示步骤进行。
四、免疫组化结果判断
c-Cbl、Cbl-b均以胞膜和/或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性染色,于显微镜400倍视野下随机选取5个有代表性的不同区域,每个视野的得分由阳性细胞的比例和显色强度两方面决定,依照阳性细胞比例:≤5%、6-25%、26-50%、51-75%、≥76%分别得0分、1分、2分、3分、4分;依照显色强度:未着色、浅黄色、棕黄色、棕褐色分别得0分、1分、2分、3分;将两项得分相乘得到该视野的最终得分,选取的5个视野得分的平均值为最后得分。最后该切片按照得分分为以下四个等级:0-1分为(-),2-4分为(+),5-7分(++),≥8分为(+++)。(-)～(+)为阴性表达,(++)(+++)为阳性表达。
五、统计分析
以SPSS16.0软件进行统计分析,c-Cbl、Cbl-b的表达与临床病理因素之间的关系应用四格表X2检验;相关性分析采用Spearman等级相关性分析;c-Cbl、Cbl-b的表达与生存时间的关系采用Kaplan-Meier生存率曲线及Log-rank检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
实验结果：
一、c.Cbl,Cbl-b的表达情况
在128例结直肠癌标本中有67例c-Cbl高表达,阳性率为52.3%;127例结直肠癌标本中有92例Cbl-b高表达,阳性率为71.7%;
二、c.Cbl,Cbl-b的表达与临床及病理因素之间的关系
经相关性统计分析显示c-Cbl的表达与性别、年龄、分化程度、浸润深度、临床分期以及淋巴结转移等病理因素无显著相关性(P＞0.05);而Cbl-b的表达与组织学分级呈负相关(r=-0.204,P=0.024),与性别、年龄、浸润深度、临床分期以及淋巴结转移等病理因素无显著相关性(P＞0.05);
三、c-Cbl,Cbl-b的表达与生存的关系
截止时间为2011年9月,在128例患者中有共有43例完成了随访,其中死亡19例,存活24例,死亡率为44.2%。C-Cbl阳性组患者生存率为60.0%,阴性组患者生存率为52.2%,阳性组略高于阴性组,但两者差异无统计学意义(P=0.514)。Cbl-b阳性组患者生存率为60.7%,阴性组患者的生存率为42.9%,阳性组高于阴性组,但两者差异不显著(P=0.220)。
为进一步明确c-Cbl、Cbl-b对结直肠癌生存的影响,针对3年生存期进行分析,c-Cbl阳性组患者生存率为85.0%,阴性组患者生存率为69.6%,阳性组高于阴性组,但两者差异不显著(P=0.267)。Cbl-b阳性组患者生存率为85.7%,阴性组患者生存率为57.1%,阳性组明显高于阴性组,差异接近有统计学差异(P=0.052)。
结论：
1、c-Cbl表达与性别、年龄、分化程度、浸润深度、临床分期以及淋巴结转移等病理因素无显著相关性;
2、Cbl-b表达与组织学分级呈负相关(r=-0.204,P=0.024),而与性别、年龄、浸润深度临床分期以及淋巴结转移等病理因素无显著相关性;
3、在生存方面,c-Cbl、Cbl-b阳性的患者均表现出优于阴性患者的趋势。