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目的:检测T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（T cell immunoglobulin and mucin domain-3,TIM-3）在鼻咽癌组织的表达,观察其表达强度和临床特征的关系,推测TIM-3的表达与鼻咽癌进展的可能关系;研究过表达TIM-3对人鼻咽癌细胞增殖、凋亡、周期、迁移、侵袭等作用的影响及可能机制。方法:1.采用免疫组织化学方法检测48例人鼻咽癌组织及12例正常鼻咽黏膜组织中TIM-3的蛋白表达水平差异,并结合临床及病理特征分析TIM-3的表达与性别、年龄、分期、淋巴结转移等参数的相关性。2.qRT-PCR和Western blotting分别检测TIM-3的mRNA和蛋白质在4种常用鼻咽癌细胞系HK-1、CNE-2、5-8F、6-10B的表达情况。3.为了研究TIM-3对鼻咽癌恶性生物学行为的影响,采用过表达TIM-3的慢病毒载体以及阴性对照（negative control,NC）的慢病毒空载体转染TIM-3表达相对较低的CNE-2和6-10B细胞,嘌呤霉素筛选后构建稳定转染细胞株CNE2-NC、CNE2-TIM3、6-10B-NC、6-10B-TIM3。采用荧光显微镜计数及流式细胞术检测转染效率;采用qRT-PCR及Western blotting验证过表达效果。4.采用CCK-8实验及平板克隆形成实验体外观察过表达TIM-3对鼻咽癌细胞系增殖能力的影响。5.采用Annexin V-PI双染流式细胞术检测TIM-3对细胞凋亡的影响;采用PI单染流式细胞术检测TIM-3对细胞周期的影响。6.采用划痕愈合实验、Transwell小室迁移实验体外观察TIM-3对细胞迁移能力的影响;采用Bio Coat Matrigel侵袭小室穿透实验观察TIM-3对细胞侵袭能力的影响。7.采用皮下注射裸鼠成瘤实验观察TIM-3对体内成瘤能力的影响。8.采用Westerning blotting检测过表达TIM-3后对鼻咽癌细胞转移相关分子MMP2、MMP9、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表达的影响。9.采用Western blotting检测过表达TIM-3后对鼻咽癌细胞SMAD7/SMAD2/SNAIL1信号轴的影响。结果:1.免疫组化结果显示:TIM-3蛋白定位于肿瘤细胞的细胞质和细胞膜,TIM-3在鼻咽癌的阳性率（91.7%,44/48）明显高于对照正常鼻咽黏膜（58.3%,7/12）,差异有统计学意义（P=0.015）;TIM-3表达和临床病理参数分析显示:TIM-3的表达与临床分期、T分级呈正相关,分别为P=0.03、P=0.012,但和年龄、性别、N分期无相关性。2.qRT-PCR及Western blotting检测结果均显示:TIM-3在鼻咽癌细胞系CNE-2、HK-1、5-8F均有表达,且在CNE-2表达相对较低,在6-10B几乎不表达。3.经过表达TIM-3慢病毒转染并用嘌呤霉素筛选后,无论是荧光显微镜计数还是流式细胞术分析结果均显示CNE2-NC、CNE2-TIM3、6-10B-NC、6-10B-TIM3四种稳转株的转染效率均达到90%以上。qRT-PCR和Western blotting结果均显示:无论在mRNA水平还是蛋白质水平,CNE2-TIM3细胞株中的TIM-3表达水平明显高于CNE2-NC及未转染CNE-2细胞（P＜0.0001）;同样,6-10B-TIM3细胞中的TIM-3表达水平明显高于6-10B-NC及未转染6-10B细胞（P＜0.0001）。以上结果表明,已成功构建过表达TIM-3及阴性对照的鼻咽癌细胞系CNE-2和6-10B的稳定表达株,并将此四株细胞用于后续实验。4.CCK-8实验显示:CNE-2细胞系,接种后24 h、48 h,CNE2-NC及CNE2-TIM3的吸光度无明显差异,但接种后72 h及以后,CNE2-TIM3的吸光度明显高于CNE2-NC（P＜0.05）;6-10B细胞系,接种后24 h,6-10B-NC及6-10B-TIM3的吸光度无明显差异,但接种后48 h及以后,6-10B-NC的吸光度明显高于6-10B-TIM3（P＜0.05）。平板克隆形成实验显示:转染TIM-3的CNE-2和6-10B细胞的克隆形成能力均明显高于NC组（P＜0.01）。5.Annexin V-PI双染流式细胞术结果显示,与NC组相比,转染TIM-3的CNE-2细胞和6-10B细胞的凋亡率均无明显差异（P＞0.05）;PI单染流式细胞术结果显示,与NC组相比,转染TIM-3的CNE-2细胞和6-10B细胞G0/G1期比例均明显增加（P＜0.001）,S期比例明显下降（P＜0.001）,G2-M期比例无明显差异（P＞0.05）。6.划痕愈合实验结果显示:CNE-2细胞,划痕24h、48h的CNE2-TIM3的愈合距离明显高于CNE2-NC（P＜0.01）;6-10B细胞,划痕12h、24h的6-10B-TIM3的愈合距离明显高于6-10B-NC（P＜0.01）。Transwell迁移及侵袭实验结果均显示,与NC组相比,过表达TIM-3的CNE-2细胞和6-10B细胞穿过基底膜的数量明显增多（P＜0.05）。7.皮下裸鼠成瘤实验显示,接种6-10B-TIM3的裸鼠肿瘤生长速度、肿瘤大小、肿瘤重量均明显高于接种6-10B-NC的裸鼠（P＜0.01）。8.Western blotting结果显示:过表达TIM-3能够显著上调6-10B和CNE-2细胞的MMP2、MMP9、N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平,下调E-cadherin蛋白表达水平（P＜0.01）。9.Western blotting检测结果显示,过表达TIM-3能够显著上调CNE-2和6-10B细胞中的p-SMAD2、SNAIL1,下调SMAD7的表达水平（P＜0.01）。但对总SMAD2的表达无明显影响（P＞0.05）。结论:1.TIM-3在人鼻咽癌组织中异常高表达,且与肿瘤分级呈正相关,预示着TIM-3有望成为鼻咽癌新的治疗靶点和分级标记。2.TIM-3通过SMAD7/SMAD2/SNAIL1轴引起上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）从而增强鼻咽癌细胞的恶性行为。