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血友病A (Hemophilia A,HA)是一种X连锁隐性遗传病,男性患者具有一条含突变基因的X染色体,导致所产生的FⅧ分子结构缺陷或致FⅧ含量减少,临床表现为程度不同的出血。鉴于本疾病的特殊性,在获取细胞用于iPS诱导时应尽量减少创伤性。本研究成功以尿液中的尿液细胞为起始细胞诱导出HA病人特异性iPS细胞,此iPS细胞能定向分化为内皮细胞,为以后的细胞及基因治疗提供了一定基础。除此之外,本研究还对非病毒方法诱导iPS细胞进行了初步探索,以提高基因治疗安全性。第一部分：血友病A病人特异性iPS细胞的诱导及鉴定目的；通过逆转录病毒的方法诱导一株1号内含子倒位和一株14号外显子点突变的HA病人特异性iPS细胞以及其内皮细胞分化潜力的验证。方法：(1)从血友病A患者的尿液中分离培养尿液细胞；(2)使用携带四种转录因子Oct4,Sox2,c-Myc和K1f4的逆转录病毒感染HA患者尿液细胞中,最终诱导出HA患者特异性的iPS细胞；(3)通过细胞形态学、碱性磷酸酶染色、干细胞表面多潜能标志物染色、细胞核型检测以及畸胎瘤体内三胚层分化对所得到的iPS细胞进行鉴定；(4)通过与小鼠OP9细胞共培养的方法将iPS细胞定向分化为内皮细胞。结果：(1)成功从患者尿液中分离出尿液细胞,并可以传代培养；(2)成功诱导出两株HA病人特异性iPS细胞并证明诱导出的iPS细胞能够表达干细胞表面多潜能标志物,并可以在裸鼠体内以形成畸胎瘤的形式向三胚层分化；(3)成功将iPS细胞诱导为内皮细胞,为以后HA的细胞治疗提供基础。结论：血友病A病人特异性iPS细胞可以由尿液细胞重编程而得到,并且可以定向分化为内皮细胞。第二部分：非病毒方法诱导iPS细胞的初步探索目的：尝试建立通过核转游离型载体的方式从尿液细胞中诱导iPS细胞的方法。方法：(1)从HA患者的尿液中分离培养尿液细胞；(2)利用核转的方法将含有编码多种因子的oriP/EBNA1游离型载体的不同组合导入尿液细胞中,观察细胞变化；(3)对诱导出来的细胞进行鉴定。结果：(1)初步筛选出了核转时最优的游离型质粒组合、最佳核转程序以及最佳培养基；(2)在诱导过程中出现了形态极其类似iPS细胞的克隆,但在后续的培养过程中发生了分化；(3)分化的细胞表现出神经细胞系样,经免疫荧光鉴定为神经细胞。结论：用过核转oriP/EBNA1游离型载体的方法可以诱导尿液细胞产生重编程,但是很容易分化成神经细胞。