流感(Influenza)是由流感病毒引起的一种严重威胁人类健康和公共卫生安全的急性呼吸道传染病。其中以A型流感病毒的危害最大，其宿主范围广，抗原变异率高，容易造成大范围流行，全球的几次流感大爆发都是由A型流感病毒引起的。流感病毒属于正粘病毒科（Orthomyxoviridae），是一种有包膜的基因组分节段的RNA病毒。其中A型流感病毒的基因组由8个单股负链RNA片段组成，每一条单股负链RNA又可分为具有调控功能的位于两端的非编码区(non-coding region，NCRs)，以及位于中间的编码区(coding regions，CDS)。目前，国际主流学术界关注点主要集中在流感病毒致病的分子机制和禽流感病毒跨种属传播机制的研究，而研究对象也主要是侧重于基因编码区的功能及编码区突变对病毒的影响。然而，研究显示流感病毒基因组的非编码区在病毒进化中起着不可或缺的作用。与此同时，流感病毒基因组的非编码区还可以影响基因组的腺苷酸化、合成、转录及病毒选择性包装等多个方面，但其中的具体机制需要进一步研究。因此，我们将对病毒非编码区功能进行系统性研究，为全面理解流感病毒复制、致病及传播的分子生物学过程提供理论基础。　　通过对A型流感病毒基因非编码区进行生物信息学分析我们发现:流感病毒各片段的片段特异性非编码区序列(segment specific NCR，ssNCR)具有较高保守性。其中，所有亚型PB2 vRNA3端的13-14位都是高度保守的“AG”核苷酸碱基;而5端的14-16位是保守的“UCG”碱基。由于病毒启动子Corkscrew结构的存在，上述3端13-14位和5端的14-15位可以形成核苷酸碱基配对，从而在一定程度上使得病毒启动子更稳定。流感病毒的非编码区是病毒包装信号的一部分，科学研究发现流感病毒的某一片段的包装信号缺失，不仅能降低该片段本身的包装效率，也能降低其余片段的包装效率。而这种影响在PB2片段中表现的最明显。这提示在病毒包装过程中是存在着一种等级制度，而PB2片段在包装所有8个基因片段过程中起着最为重要的作用。所以本研究在A型流感病毒PB2片段上，探讨毗邻启动子保守碱基的功能。　　首先，为了阐明这些位点的碱基在病毒复制时的作用，我们以A/WSN/1933(H1N1)作为病毒骨架，在PB2片段上引入系列突变，运用反向遗传学操作技术来拯救WSN(wild type)以及WSN(mutations)病毒株。我们通过比较各组病毒生长曲线发现，PB2基因3端13-15位与5端14-16位的碱基突变对病毒复制效率产生差异影响，并且这种影响作用会随突变位点离启动子距离增大而减小。　　为了确定这些位点的碱基是否通过调节聚合酶活性来影响病毒的生长繁殖，我们在小型复制子中引入上述突变，来说明RNA聚合酶活性的与病毒的增殖能力之间的关系。结果显示，PB2基因3端13-15位与5端14-16位的碱基突变对报告基因HA蛋白及RNA表达水平有不同程度的影响，并且PB2基因3端13位与5端14位的碱基的聚合酶活性和病毒的增殖能力是严格的对应关系。这提示了这些位点突变很可能是通过影响聚合酶活性来影响病毒复制效率。　　我们之前研究报道A型流感病毒HA的亚型特异性非编码区会影响流感病毒HA片段包装，而且病毒的包装能力也是影响病毒增殖能力的因素之一。此外，我们发现PB2基因3端14-15位与5端15-16位的碱基的聚合酶活性和病毒的增殖能力并不是对应关系，为了确定这些位点的病毒包装效率与病毒增殖能力的关系以及更深入了解上述位点的功能，我们利用病毒包装实验对这些位点对病毒包装的影响进行了检测。结果显示，PB2基因3端14-15位与5端15-16位的碱基突变对病毒的包装效率有差异影响，并且这影响和病毒复制能力有严格的一致性。这提示这些位点的病毒包装能力是决定病毒复制能力的主要因素。　　综上，我们在A型流感病毒PB2基因3端13-15位与5端14-16位上的碱基构建系列突变，运用反向遗传学操作技术、小型复制子系统和病毒包装实验探究这些保守核苷酸碱基的生物学功能，进一步丰富了人们对于A型流感病毒非编码区的认识，也为我们理解A型流感病毒的基因表达调控提供了一个新视角。同时，为流感病毒疫情的防治提供理论基础。