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民族药起源于少数民族地区,具有鲜明的地域性和民族特色。近年来,党和政府高度重视民族药的发掘整理等工作,现已取得了显著的成果,但整体研究水平依然偏低,发展依旧缓慢。痛风汤散属于传统的藏药,由勒哲（Tinospora sinensis）、诃子（Terminaliachebula Retz）、渣驯膏（Trogopterori faeces）三味藏药组成。“藏药标准”中记载,该散剂用于治疗痛风、关节炎等关节炎症性疾病及伴随的疼痛和肿胀。目前,有关痛风汤散的药理作用和活性成分的研究甚少。本课题组前期研究表明痛风汤散可显著降低高尿酸血症模型大鼠体内尿酸水平,但其抗高尿酸药效物质仍不十分清楚。黄嘌呤氧化酶（XOD）是引发高尿酸血症和痛风疾病的关键酶,其催化底物黄嘌呤或次黄嘌呤生成尿酸。为了进一步探究痛风汤散发挥降尿酸作用的有效成分,本研究采用亲和超滤液质联用技术对其潜在XOD抑制剂进行研究。主要内容如下:1不同极性部位痛风汤散对体外XOD活性的抑制作用及活性部位成分研究首先,采用体外XOD酶孵育体系并结合分光光度法探究痛风汤散不同极性部位对XOD的抑制作用并确定其活性部位。然后,采用超高效液相色谱串联飞行时间质谱技术（UHPLC-Q-TOF-MS/MS）对活性部位进行化学成分分析鉴定。通过优化XOD和黄嘌呤的浓度,最终确定高通量XOD活性孵育体系,体系中XOD终浓度为0.025 U/m L,黄嘌呤终浓度为0.12 m M。并应用该体系测定痛风汤散不同极性部位对XOD的抑制作用。结果发现,60%乙醇水洗脱部位（60X）对XOD的抑制活性最强,其次为30%乙醇水洗脱部位（30X）、90%乙醇水洗脱部位（90X）以及水洗脱部位（SX）。60X抑制XOD的IC50为30.9μg/m L,活性优于痛风汤散提取物（CF）,30X、90X以及SX的IC50分别为92.83、113.4、447μg/m L。通过体外XOD抑制实验发现,痛风汤散主要活性物质可能集中在60X。因此,对60X进行了化学成分的分析,共鉴定出了113个化合物。2基于亲和超滤质谱联用技术筛选痛风汤散60X中黄嘌呤氧化酶抑制剂及结构鉴定首先,采用亲和超滤液质谱联用技术筛选痛风汤散60X中潜在XOD抑制剂。然后采用ESI-LTQ-Oribitrap/MS对筛选成分进行鉴定,并采用体外XOD酶孵育体系对潜在的XOD抑制剂的活性进行验证。亲和超滤筛选实验过程中通过加入非不索坦阻断剂,来排除假阳性结合,发现有九个化合物峰有明显的吸收差异,初步推断这九个化合物可能与XOD活性位点有结合。采用ESI-LTQ-Oribitrap/MS于负离子模式下进行检测,通过对成分的二级质谱的解析以及标准品保留时间进行比对,确定了六个化合物的结构,分别为:1,3,6-三-O-没食子酰-β-D-葡萄糖（TRG）、1,2,3,6-四-O-没食子酰-β-D-葡萄糖（TEG）、1,2,3,4,6-五-O-没食子酰-β-D-葡萄糖（PGG）、诃子酸、N-反式-阿魏酰酪胺、羟基积雪草酸。并进一步采用体外XOD酶孵育体系并结合分光光度法验证了超滤筛选结果的准确性,结果表明,六个化合物对XOD均有一定的抑制作用。其中N-反式-阿魏酰酪胺、羟基积雪草酸以及诃子酸对XOD的抑制作用较弱。TRG、TEG和PGG对XOD的抑制作用较强,IC50值分别为54.46、15.91、6.579μg/m L,其中PGG对XOD的抑制作用与别嘌醇(IC50=1.694μg/m L)相当。其中,PGG为已报道的具有XOD抑制活性的化合物,TRG和TEG均为首次报道具有具有较强XOD抑制活性。3活性化合物对XOD的抑制作用研究本章节首先通过分子对接技术进一步探究了超滤筛选结果的准确性,并进一步对活性较好的化合物进行了抑制类型的判断及抑制机理研究。分子对接结果表明六个化合物均与XOD对接成功,对接得分由高到低依次为:PGG＞TEG＞TRG＞诃子酸＞N-反式阿魏酰酪胺＞羟基积雪草酸。体外活性实验结果也表明TRG、TEG和PGG对XOD抑制作用较强,与分子对接结果吻合。TRG、TEG和PGG三个化合物随着没食子酰基基团数目的增加,对XOD的抑制活性依次增强。酶动力学实验结果表明,PGG、TEG和TRG三个化合物对XOD的抑制类型均为可逆混合型抑制剂,抑制常数4)分别为0.24μM、6.31μM、20.01μM。荧光光谱实验结果表明,TRG、TEG和PGG三个化合物可能与XOD活性位点附近的酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）或苯丙氨酸（Phe）相互作用导致XOD产生荧光猝灭现象。圆二色谱实验结果表明,TRG、TEG和PGG三个化合物均可使XOD中的α-helix和β-sheet含量降低,Random coil的含量升高,从而引起XOD的活性结构域产生变化,降低XOD的活性。4基于HK-2细胞模型的三个活性化合物促进尿酸排泄作用研究采用尿酸刺激HK-2细胞模型探究三个活性较好的化合物对葡萄糖转运蛋白9（GLUT9）和尿酸盐阴离子转运体1（URAT1）表达的影响。结果发现,TRG、TEG和PGG三个化合物低、高剂量下可显著降低HK-2尿酸模型细胞URAT1和GLUT9蛋白表达水平。结果进一步表明,TRG、TEG和PGG三个化合物不仅可以从源头降低尿酸的生成,还可以通过调节尿酸转运相关蛋白促进体内尿酸的排出。5基于网络药理学的六种XOD抑制剂在TFTS中的潜在作用机制采用网络药理学技术对六个化合物治疗痛风/高尿酸血症可能的作用靶点及通路进行探究。结果显示,六个化合物除了作用于XOD外,还可能作用于NOS2、PTGS2等靶点发挥治疗痛风/高尿酸血症作用。GO富集分析结果显示,六个化合物对痛风/高尿酸血症的调节通过steroid hormone mediated signaling pathway、transcription initiation from RNA polymerase II promoter、steroid hormone receptor activity、RNA polymerase II transcription factor activity、ligand-activated sequence-specific DNA binding等功能完成。KEGG结果显示,六个化合物可能通过作用于Metabolic pathways、Insulin resistance、Regulation of lipolysis in adipocytes、Arachidonic acid metabolism等通路发挥抗痛风/高尿酸血症的作用。