血吸虫病(schistosomiasis)是由血吸虫寄生人体所引起的一种寄生虫病。血吸虫病仍是我国以及其他热带亚热带地区发展中国家重要的公共卫生问题之一,严重影响流行地区居民的身体健康以及社会和经济的发展。我国主要流行的是日本血吸虫病。日本血吸虫病造成的病理损伤主要是肝脏虫卵肉芽肿反应以及继发的肝纤维化、脾脏肿大并伴脾脏功能亢进等临床表现。目前,针对血吸虫病患者的脾脏病理损伤问题,除了临床通常选用的脾脏全切或部分切除的治疗方式,并无有效的内科治疗方法。因此,我们有必要对血吸虫病所致脾脏病理损伤的相关致病机制进行研究,为临床治疗提供依据。血吸虫病造成的脾脏免疫细胞功能改变是导致脾脏病理损伤的关键因素。日本血吸虫感染小鼠的过程中,常伴随脾脏肿大并脾功能亢进。吡喹酮是一种传统的抗血吸虫药物,但随着对吡喹酮治疗血吸虫病的研究深入,发现吡喹酮不仅具有杀虫作用,其在调节免疫细胞的功能方面也起着重要的作用。本实验室前期研究就已发现,在体内实验中,血吸虫病慢性期小鼠经吡喹酮治疗后,脾脏病理损伤得到明显改善,且巨噬细胞炎性因子的基因表达和相关细胞因子的分泌也均受到明显抑制。然而,巨噬细胞作为介导脾脏病理损伤过程的重要免疫细胞亚群,受吡喹酮影响发生哪些功能变化及相应的机制,尚未见详细研究报道。本研究从巨噬细胞系入手,研究吡喹酮刺激对相关炎症因子的调控作用及可能机制,为进一步揭示吡喹酮通过调节炎症因子的表达进而改善器官病理损伤的作用提供试验依据。巨噬细胞既是固有免疫细胞,也是抗原递呈细胞,是天然免疫和获得性免疫的纽带。在免疫反应过程中,巨噬细胞受到不同诱导因素作用之后,可向不同方向分化,形成经典激活的巨噬细胞(M1型)和替代激活的巨噬细胞(M2型),并分泌与之相关的细胞因子和酶类物质等,产生不同的功能作用。M1型巨噬细胞活化呈现出炎性免疫应答,主要介导宿主防御和抗肿瘤免疫;M2型巨噬细胞呈现抑制炎性应答,主要发挥抑制作用和调节损伤修复的作用。巨噬细胞参与炎症反应的发生发展在许多相关疾病的进程中起着重要的作用。炎症小体(Inflammasome)是一种由机体胞浆内模式识别受体(PRRs)参与组成的多蛋白复合体,主要参与天然免疫反应中caspase-1激活,并介导IL-1β、IL-18的前体产生成熟细胞因子以及诱导细胞凋亡。目前已发现的通过形成炎症小体发挥功能作用的分子包括NLRP1、NLRP3、IPAF和AIM-2等,其中NLRP3是研究最为清楚地一种炎症小体,NLRP3表达的失调对于慢性炎症性疾病的发展起着重要作用。根据已有报道,多种microRNA参与了炎症反应的发生与发展,microRNA对炎症反应的调节作用也引起了普遍关注。MicroRNA(miRNA、微小RNA)是在多种真核细胞和病毒中发现的一类高度保守的内源性非编码单链RNA,通过与靶mRNA互补配对而在转录水平上对基因的表达进行负调控,导致mRNA的翻译抑制或降解,从而调控一系列生理病理过程。虽然已有研究显示,miRNA在炎症反应的发生发展过程中担任着重要的作用,但是关于吡喹酮抑制炎症反应的过程中,是否有miRNA的参与以及参与的具体方式和机制仍需要我们进一步的探究和证明。我们前期的实验发现吡喹酮能抑制M1型巨噬细胞炎症相关因子的表达与分泌。本研究中,我们检测了参与调节炎症反应的重要miRNA的表达变化,发现吡喹酮能够显著降低miRNA-21的表达,同时促进Smad7的表达升高,最后我们进一步探究了吡喹酮与miRNA-21的相互关系在调节炎症反应的过程中起到的重要作用。本研究获得如下主要结果:1.血吸虫感染小鼠慢性期脾脏巨噬细胞中M1型巨噬细胞占主导地位为了解血吸虫感染小鼠慢性期脾脏巨噬细胞分化、功能的情况,我们检测了有关M1、M2型巨噬细胞的特定基因Arg-1、iNOS、TNF-α和相关炎症因子基因NLRP3、IL-1β的表达。结果显示:在血吸虫感染慢性期,脾脏巨噬细胞高表达iNOS、TNF-α基因,而低表达Arg-1基因,显示慢性期巨噬细胞以M1型巨噬细胞为主;同时,相关炎症因子基因以及向相关细胞信号通路基因的检测结果显示,M1型巨噬细胞高表达NLRP3、IL-1β等炎症因子和Smad7、NF-KB细胞信号通路分子。这些结果提示:感染血吸虫慢性期M1型巨噬细胞可能通过高表达Smad7、NF-KB基因进而促进炎症反应,同时也提示,血吸虫感染慢性期,脾脏和肝脏可能处于不同的免疫环境和状态。2.吡喹酮显著降低M1型巨噬细胞中炎症相关因子的表达为了进一步研究M1型巨噬细胞炎症因子表达情况以及吡喹酮对其表达的影响,通过体外刺激RAW264.7巨噬细胞系并使用不同的实验方法来检测相关因子表达。结果显示:体外诱导的M1型巨噬细胞相对于M2型巨噬细胞高表达炎症相关因子(NLRP3、IL-1β);经吡喹酮刺激后,M1型巨噬细胞的炎症相关因子的表达显著降低。我们使用ELISA法对细胞分泌的IL-1β进行检测,显示与基因水平的检测结果相吻合。这些结果提示:体外细胞系的研究和体内脾脏M1型巨噬细胞高表达炎症因子方面的结果相一致,并且,吡喹酮的抑炎作用可能与抑制NLRP3等炎症因子的表达进而调节炎症反应的过程有关。3.M1型巨噬细胞经吡喹酮刺激后miRNA-21的表达降低同时Smad7的表达上升为了进一步探究吡喹酮对M1型巨噬细胞的相关炎症因子表达的影响,我们通过RT-PCR的方法分别检测了相关miRNA和细胞信号通路基因的表达。结果显示,在吡喹酮作用下,M1型巨噬细胞炎症相关因子(NLRP3、IL-1β)表达明显降低,miRNA-21表达也降低,而Smad7的表达却明显上升。结果提示,吡喹酮抑制炎症反应的作用可能与抑制miRNA-21的表达和增强Smad7的表达有关。4.经吡喹酮刺激的M1型巨噬细胞通过转染miRNA-21 mimic后炎症因子的表达重新上升为了进一步探究吡喹酮调节M1型巨噬细胞炎症相关因子表达的分子机制,我们采用转染技术将miRNA-21的mimic转染到M1型巨噬细胞中,然后检测相关炎症因子的表达和细胞信号通路分子的表达,并采用ELISA法检测相关炎症因子的分泌。结果显示:转染miRNA-21的mimic到巨噬细胞后,相关炎症因子(NLRP3)的表达重新升高,而Smad7表达则降低;同时ELISA方法检测到炎症因子IL-1β的分泌升高。在吡喹酮刺激M1型巨噬细胞之前转染miRNA-21的mimic,然后检测Smad7的表达变化,我们发现Smad7的表达并没有得到明显升高。以上结果提示,吡喹酮可能是通过调节miRNA-21的表达来间接调节Smad7的表达,进而调控炎症因子的表达,以此达到调控炎症反应的作用。本研究增进了我们对吡喹酮通过调节巨噬细胞炎症因子表达发挥抗炎作用和机制的认识。虽然我们试验揭示了巨噬细胞通过降低miRNA-21的表达进而促进Smad7的上升,在下游炎症反应的发生发展过程中起着重要的调节作用,但是关于miRNA-21与Smad7怎样进一步调节炎症反应以及其它相关炎症反应通路在炎症反应的过程中承担的作用还有待进一步的探讨。