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【研究背景】
由尿路致病性大肠杆菌引起的尿路感染是一种持续性感染，在机体通过免疫应答与UPEC相互作用的过程中，细菌并没有被完全清除，少部分细菌始终存在于膀胱组织中，成为复发性感染源。大量关于UPEC持续性感染发生机制的研究，对此做出了一定的解释。UPEC在到达并侵袭膀胱黏膜上皮后，其在上皮细胞内增殖和释放毒性物质来裂解上皮细胞。细胞裂解后，释放出来的细菌又会继续侵入邻近的细胞，如此不断地更新。另外，也有研究显示UPEC在尿道上皮细胞内会形成胞内细菌团(Intracellular Bacterial Communities, IBCs)和静止胞内菌(quiescent intracellular reservoirs, QIRs)，而这些结构能够帮助细菌抵御抗生素以及效应细胞的杀菌作用。由此可知，UPEC可以将尿道上皮细胞作为庇护所来促进其在宿主体内的持续存在。抗原提呈细胞，如树突状细胞和巨噬细胞，在机体对抗尿路感染的免疫应答中发挥着重要作用，但这些细胞与病原体相互作用的机制目前尚不明确。我们的前期研究显示。多种革兰氏阴性菌可以通过其脂多糖核心(LPS core)结构与巨噬细胞表达的C型凝集素CD209相互作用，从而促进细菌在宿主体内的感染和播散。UPEC作为引起尿路感染的主要病原体，可能会利用与其他革兰氏阴性菌相同的方式，以CD209作为受体侵袭宿主细胞，从而促进其持续感染。本研究将利用临床分离菌株以及尿路感染实验室菌株来探究UPEC与宿主细胞的相互作用，并通过动物实验模型进一步证明CD209在尿路感染中的作用。
【实验方法】
1.获取临床分离尿路致病性大肠杆菌菌株
通过临床膀胱炎患者尿培养获得分离菌株，然后通过聚合酶链式反应(PCR)对所获菌株进行鉴定和筛选，最终获得UPEC临床分离株。
2.检测临床分离株O抗原表达情况
首先利用细菌脂多糖(LPS)提取试剂盒提取各个菌株的LPS，在SDS-PAGE电泳后，通过银染方法对细菌LPS进行显色，观察每个菌株LPS的结构以及O抗原表达情况。
3.细胞侵袭实验
3.1利用UPEC菌株感染中国仓鼠卵巢上皮细胞(CHO)以及相应的表达人源性CD209受体(CHO-hDC-SIGN)和鼠源性CD209受体(CHO-mSIGNR1)的细胞系，通过庆大霉素保护实验检测各个细菌对上述细胞系的侵袭能力，观察O抗原的表达是否会影响UPEC的侵袭能力。
3.2利用UPEC菌株分别感染野生型小鼠和SIGNR1敲除(SIGNR1-/-)小鼠的腹腔巨噬细胞，通过庆大霉素保护实验以及体外免疫荧光实验观察SIGNR1受体对于UPEC侵袭作用的影响。
3.3利用CD209相应抗体以及LPScore类似物做庆大霉素保护抑制实验，证明CD209可促进UPEC对宿主细胞的侵袭。
4.尿路感染动物模型
4.1建立小鼠尿路感染模型，通过膀胱插管途径接种UPEC至野生型小鼠和SIGNR1敲除小鼠膀胱，在适当的时间点取样检测小鼠尿液及膀胱组织的细菌载量。比较两种小鼠在感染后体内细菌载量差异。
4.2在动物模型中通过免疫组化、免疫荧光和酶联免疫吸附试验(ELISA)等方法检测小鼠膀胱组织炎症的严重程度以及相关炎症指标，以观察SIGNR1受体在小鼠膀胱炎中的作用。
【结果】
1.与野生型小鼠相比，来自SIGNR1敲除小鼠的腹腔巨噬细胞对UPEC的吞噬能力显著减弱
分别取野生型小鼠和SIGNR1敲除小鼠的腹腔巨噬细胞与UPEC菌株相互作用，通过庆大霉素保护实验以及免疫荧光检测巨噬细胞对各个UPEC菌株的吞噬能力。结果显示，SIGNR1敲除小鼠腹腔巨噬细胞对6株UPEC的侵袭能力显著减弱，提示SIGNR1参与巨噬细胞与UPEC的相互作用。
2.人源性DC-SIGN和鼠源性SIGNR1是宿主细胞吞噬UPEC的受体
利用UPEC菌株分别与CHO细胞，CHO-hDC-SIGN细胞和CHO-mSIGNR1细胞相互作用，通过庆大霉素保护实验检测各个细胞系对UPEC的吞噬能力。结果显示，表达hDC-SIGN和mSIGNR1的CHO细胞对UPEC的吞噬能力显著增加，并且这种吞噬作用可以分别被抗hDC-SIGN抗体和抗hDC-SIGN抗体抑制，证实了UPEC与CD209受体结合的特异性。
3.UPEC与CD209的相互作用不依赖LPScore
LPS银染发现，临床分离株UPEC2和UPEC4无O抗原表达，但是他们在对CHO-hDC-SIGN细胞和CHO-mSIGNR1细胞的侵袭能力与其他表达O抗原的菌株无显著性差异，并且其相互作用不能被LPScore类似物甘露糖(Mannan)抑制，提示UPEC与CD209的结合可能不是由细菌LPScore介导。
4.与野生型小鼠相比，UPEC在SIGNR1敲除小鼠体内播散到肝脏和脾脏的细菌量明显减少
分别以腹腔注射方式将UPEC菌悬液接种至野生型和SIGNR1敲除鼠的腹腔，感染后24小时，无菌操作取出小鼠的肝脏，脾脏和肠系膜组织匀浆后涂板培养，观察细菌向各个器官播散情况。结果显示，SIGNR1敲除小鼠肝脏和脾脏的细菌载量明显低于野生型小鼠。
5.小鼠膀胱炎模型中，SIGNR1敲除鼠对细菌的清除能力受损
在通过小鼠膀胱插管接种细菌后，在不同的时间点收集感染小鼠的尿液和膀胱组织标本，对细菌载量进行分析，结果显示SIGNR1敲除鼠的尿液和膀胱组织细菌载量在相同时间点明显高于野生型小鼠。
通过组织化学方法对感染后的小鼠膀胱组织进行分析，发现SIGNR1敲除鼠的膀胱组织炎症比野生型小鼠更重。
利用ELISA方法对感染后膀胱组织细胞因子进行检测，发现白介素-2(IL-2)，白介素-10(IL-10)以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达均增高，但是在野生型小鼠和SIGNR1敲除鼠中无统计学差异，提示SIGNR1敲除小鼠更重的炎症反应可能不是由这几种炎性细胞因子的表达水平决定的。
【结论】
本研究利用UPEC临床分离株和膀胱炎实验室菌株首次证明了UPEC可以利用表达于巨噬细胞表面的C型凝集素CD209作为受体侵袭宿主细胞，而UPEC-CD209相互作用可能不是由LPScore介导。在小鼠膀胱炎模型中，本研究证明了SIGNR1参与机体对侵入的UPEC的清除。
由尿路致病性大肠杆菌引起的尿路感染是一种持续性感染，在机体通过免疫应答与UPEC相互作用的过程中，细菌并没有被完全清除，少部分细菌始终存在于膀胱组织中，成为复发性感染源。大量关于UPEC持续性感染发生机制的研究，对此做出了一定的解释。UPEC在到达并侵袭膀胱黏膜上皮后，其在上皮细胞内增殖和释放毒性物质来裂解上皮细胞。细胞裂解后，释放出来的细菌又会继续侵入邻近的细胞，如此不断地更新。另外，也有研究显示UPEC在尿道上皮细胞内会形成胞内细菌团(Intracellular Bacterial Communities, IBCs)和静止胞内菌(quiescent intracellular reservoirs, QIRs)，而这些结构能够帮助细菌抵御抗生素以及效应细胞的杀菌作用。由此可知，UPEC可以将尿道上皮细胞作为庇护所来促进其在宿主体内的持续存在。抗原提呈细胞，如树突状细胞和巨噬细胞，在机体对抗尿路感染的免疫应答中发挥着重要作用，但这些细胞与病原体相互作用的机制目前尚不明确。我们的前期研究显示。多种革兰氏阴性菌可以通过其脂多糖核心(LPS core)结构与巨噬细胞表达的C型凝集素CD209相互作用，从而促进细菌在宿主体内的感染和播散。UPEC作为引起尿路感染的主要病原体，可能会利用与其他革兰氏阴性菌相同的方式，以CD209作为受体侵袭宿主细胞，从而促进其持续感染。本研究将利用临床分离菌株以及尿路感染实验室菌株来探究UPEC与宿主细胞的相互作用，并通过动物实验模型进一步证明CD209在尿路感染中的作用。
【实验方法】
1.获取临床分离尿路致病性大肠杆菌菌株
通过临床膀胱炎患者尿培养获得分离菌株，然后通过聚合酶链式反应(PCR)对所获菌株进行鉴定和筛选，最终获得UPEC临床分离株。
2.检测临床分离株O抗原表达情况
首先利用细菌脂多糖(LPS)提取试剂盒提取各个菌株的LPS，在SDS-PAGE电泳后，通过银染方法对细菌LPS进行显色，观察每个菌株LPS的结构以及O抗原表达情况。
3.细胞侵袭实验
3.1利用UPEC菌株感染中国仓鼠卵巢上皮细胞(CHO)以及相应的表达人源性CD209受体(CHO-hDC-SIGN)和鼠源性CD209受体(CHO-mSIGNR1)的细胞系，通过庆大霉素保护实验检测各个细菌对上述细胞系的侵袭能力，观察O抗原的表达是否会影响UPEC的侵袭能力。
3.2利用UPEC菌株分别感染野生型小鼠和SIGNR1敲除(SIGNR1-/-)小鼠的腹腔巨噬细胞，通过庆大霉素保护实验以及体外免疫荧光实验观察SIGNR1受体对于UPEC侵袭作用的影响。
3.3利用CD209相应抗体以及LPScore类似物做庆大霉素保护抑制实验，证明CD209可促进UPEC对宿主细胞的侵袭。
4.尿路感染动物模型
4.1建立小鼠尿路感染模型，通过膀胱插管途径接种UPEC至野生型小鼠和SIGNR1敲除小鼠膀胱，在适当的时间点取样检测小鼠尿液及膀胱组织的细菌载量。比较两种小鼠在感染后体内细菌载量差异。
4.2在动物模型中通过免疫组化、免疫荧光和酶联免疫吸附试验(ELISA)等方法检测小鼠膀胱组织炎症的严重程度以及相关炎症指标，以观察SIGNR1受体在小鼠膀胱炎中的作用。
【结果】
1.与野生型小鼠相比，来自SIGNR1敲除小鼠的腹腔巨噬细胞对UPEC的吞噬能力显著减弱
分别取野生型小鼠和SIGNR1敲除小鼠的腹腔巨噬细胞与UPEC菌株相互作用，通过庆大霉素保护实验以及免疫荧光检测巨噬细胞对各个UPEC菌株的吞噬能力。结果显示，SIGNR1敲除小鼠腹腔巨噬细胞对6株UPEC的侵袭能力显著减弱，提示SIGNR1参与巨噬细胞与UPEC的相互作用。
2.人源性DC-SIGN和鼠源性SIGNR1是宿主细胞吞噬UPEC的受体
利用UPEC菌株分别与CHO细胞，CHO-hDC-SIGN细胞和CHO-mSIGNR1细胞相互作用，通过庆大霉素保护实验检测各个细胞系对UPEC的吞噬能力。结果显示，表达hDC-SIGN和mSIGNR1的CHO细胞对UPEC的吞噬能力显著增加，并且这种吞噬作用可以分别被抗hDC-SIGN抗体和抗hDC-SIGN抗体抑制，证实了UPEC与CD209受体结合的特异性。
3.UPEC与CD209的相互作用不依赖LPScore
LPS银染发现，临床分离株UPEC2和UPEC4无O抗原表达，但是他们在对CHO-hDC-SIGN细胞和CHO-mSIGNR1细胞的侵袭能力与其他表达O抗原的菌株无显著性差异，并且其相互作用不能被LPScore类似物甘露糖(Mannan)抑制，提示UPEC与CD209的结合可能不是由细菌LPScore介导。
4.与野生型小鼠相比，UPEC在SIGNR1敲除小鼠体内播散到肝脏和脾脏的细菌量明显减少
分别以腹腔注射方式将UPEC菌悬液接种至野生型和SIGNR1敲除鼠的腹腔，感染后24小时，无菌操作取出小鼠的肝脏，脾脏和肠系膜组织匀浆后涂板培养，观察细菌向各个器官播散情况。结果显示，SIGNR1敲除小鼠肝脏和脾脏的细菌载量明显低于野生型小鼠。
5.小鼠膀胱炎模型中，SIGNR1敲除鼠对细菌的清除能力受损
在通过小鼠膀胱插管接种细菌后，在不同的时间点收集感染小鼠的尿液和膀胱组织标本，对细菌载量进行分析，结果显示SIGNR1敲除鼠的尿液和膀胱组织细菌载量在相同时间点明显高于野生型小鼠。
通过组织化学方法对感染后的小鼠膀胱组织进行分析，发现SIGNR1敲除鼠的膀胱组织炎症比野生型小鼠更重。
利用ELISA方法对感染后膀胱组织细胞因子进行检测，发现白介素-2(IL-2)，白介素-10(IL-10)以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达均增高，但是在野生型小鼠和SIGNR1敲除鼠中无统计学差异，提示SIGNR1敲除小鼠更重的炎症反应可能不是由这几种炎性细胞因子的表达水平决定的。
【结论】
本研究利用UPEC临床分离株和膀胱炎实验室菌株首次证明了UPEC可以利用表达于巨噬细胞表面的C型凝集素CD209作为受体侵袭宿主细胞，而UPEC-CD209相互作用可能不是由LPScore介导。在小鼠膀胱炎模型中，本研究证明了SIGNR1参与机体对侵入的UPEC的清除。