背景黑色素瘤是多发生在皮肤的高度恶性肿瘤,起源于黑色素细胞。皮肤黑色素瘤的突出特点是发病早期的转移率高,致死率高,对单纯的放疗化疗不敏感,大多数的患者预后比较差。在黑色素瘤的患者中大约50%存在BRAF突变。BRAF是RAF激酶家族的成员。RAF家族包括ARAF、BRAF、CRAF。目前研究发现BRAF突变导致所编码的氨基酸的突变,激活下游的MAPK/MEK-ERK信号通路,促进细胞的迁移和增殖,触发肿瘤细胞的增长。目前,临床上的治疗多用MEK/ERK抑制剂ipilimumab和PLX4032(vemurafenib)等靶向药物治疗BRAF突变已经取得较好效果。PLX4032是第一个用于临床的治疗黑色素瘤的靶向抑制剂。PLX4032用于晚期黑色素瘤见效快,反应灵敏。但是,这类靶向抑制剂通常只能维持疗效8-9个月。然后患者很快出现了耐药性,耐药之后的肿瘤又实现快速的增长。控制耐药性是黑色素瘤治疗的关键问题。目前已经有多个研究试图阐明耐药机制。有研究表明,在BARF突变患者的间质细胞中发现HGF,并发现间质细胞分泌HGF与RAF抑制剂的耐药性之间有相关关系。Johannessen等发现COT/Tpl2在细胞中的过度表达也是耐药性产生的原因。还有,在体外诱导的PLX4032(vemurafenib)的耐药细胞中发现了NRAS突变。同时,在PLX4032(vemurafenib)耐药的患者的转移的淋巴结中也发现了NRAS突变。这说明可能是NRAS突变激活MAPK通路,导致黑色素瘤肿瘤细胞对靶向抑制剂的耐药。有研究认为BRAF自身的突变导致了耐药性的产生。BRAF V600E突变在黑色素瘤中是最常见的BRAF突变。而在这其中大约79%是BRAF V600E突变。有趣的是,临床上发现,BRAF V600E突变PLX4032(vemurafenib)、GSK1120212 (trametinib)抗药一部分患者预后较差。最近有研究证明EGFR (epidermal growth factor receptor)的活化与BRAFV600E或MEK抑制剂抗药性相关。Anirudh Prahallad等人发现BRAF V600E抑制剂可以导致一部分人群EGFR的活化。而EGFR的活化可以增强癌细胞对BRAF抑制剂的耐受。Chong Sun等人在黑色素瘤细胞研究中发现EGFR活化导致黑色素瘤细胞富集在BRAF V600E或MEK抑制剂下。我们分析了BRAF V600E人群黑色素瘤抗药的患者的初患病时患处的基因变化,以及该人群用药前后的基因变化。希望通过揭示这一过程的基因变化为BRAF V600E耐药人群的黑色素瘤的治疗提供可能的靶向位点,为BRAF V600E黑色素瘤抗药患者人群的特异治疗提供可能的方向。方法我们选取GEO数据库GSE50535的SRR961663、SRR961664、SRR961665, SRR961666、SRR961667、SRR961668,一共6例样本。这6例样本来自3位患者均是含有BRAF V600E突变的黑色素瘤的患者。其中SRR961663、 SRR961664来自Patient#5患者,SRR961665、SRR961666来自Patient#3患者,SRR961667、SRR961668来自Patient#2患者。SRR961663、SRR961665、 SRR961667是用药前样本。SRR961664、SRR961666、SRR961668是获得耐药后样本。使用tophat组装Rna-seq数据,并用cufflinks分析差异表达基因。在TCGA数据库中选取了黑色素瘤且BRAF V600E突变的130例样本和正常样本,使用Edger筛选差异基因,P<0.05认为有显著的差异。差异基因的功能富集分析我们使用使用了DAVID注释数据库,包括基因的GO分析、通路分析、P<0.05认为是显著的富集。结果BRAF V600E突变患者耐药后基因变化我们分析的GSE50535黑色素瘤3个患者耐药前后的6例样本,得到94个差异表达基因,62个基因上调,32个基因下调。为了更好理解差异表达基因的意义,我们对94差异表达基因进行功能注释。我们发现,在细胞组分方面,差异表达基因主要聚集在与膜结构相关的方面。占总数33.25%的差异基因,有30个基因聚集在质膜(P=0.002)方面。同时,我们也发现,占总数22.58%的21差异基因与质膜部分(P=0.002)有关。同时,BGN, COL6A3, COL6A2, CACNA1C这个四个基因也显著富集在肌纤维膜(P=0.003)。在细胞过程方面,我们积极的调节免疫系统的过程(P=1.08E-05)是最显著的聚集的方面,有PTPRC, CORO1A, IKZF1, CLU, CD4, INPP5D, C1QC, CD74, HLA-DRA,9个基因显著富集在这个条目里。另外,其他显著富集的条目也都与免疫过程相关,比如,免疫反应(P=0.003),积极的调节淋巴细胞活化方面(P=7.29E-05),淋巴细胞分化(P=9.84E-05)等。除此之外,也有8个基因富集在积极的调节细胞分化方面(P=7.29E-05)。在细胞功能方面,有5个基因显著富集在细胞外基质的结构组成(P=5.43E-04)。有4个基因显著富集在糖蛋白绑定方面(P=5.61E-04)o PTPRC, CORO1A, ITGB2, CD4, TNNI3, TOP2B显著富集在激酶绑定(P=0.001)。我们也对94个差异基因进行了KEGG通路分析。我们发现细胞粘附分子是最有显著的富集的通路。BRAF V600E突变患者耐药后单个患者基因变化分析医学专家在临床中发现,人体肿瘤千差万别,即使是同一个部位的肿瘤,治疗效果和方法也应因人而异。因此在治疗过程中,只有同病异治、因人而异、实施个体化治疗,才能针对不同类型的病人选择适合他们的药物。所以,我们也分别分析了3例患者耐药前后的基因变化,以期望在单一的患者中独特的基因表达变化。我们分析了Patient#5患者耐药前SRR961663样本以及耐药后SRR961664样本,发现显著差异的基因185个。对显著差异的基因进行功能注释,我们发现主要集中在免疫反应(immune response)、免疫球蛋白样折叠(Immunoglobulin-like fold),胞外区域(extracellular region),二硫键(disulfide bond,plasma membrane),N链接糖基化位点(glycosylation site：N-linked (GlcNAc...)),信号(signal),信号肽(signal peptide),糖蛋白(glycoprotein)方面。其中,占差异基因的36.26%的：66个基因富集在糖蛋白(glycoprotein)方面。占差异基因34.61%的：63个基因富集在信号肽(signal peptide)方面。占差异基因19.78%的：36个基因富集在免疫反应(immune response)方面。同时,我们对185个显著差异基因进行KEGG通路分析,P-value<0.05,主要富集在两个方面。有11个基因富集在抗原加工与递呈(Antigen processing and presentation)(P=1.79E-08)中,有7个基因富集在移植物抗宿主病(Graft-versus-host disease)(P=3.72E-06)。我们分析了Patient#3患者耐药前SRR961665样本以及耐药后SRR961666样本,最终我们发现118个显著差异基因。然后,我们对这118个显著差异基因进行功能注释聚类聚类分析,发现这些差异基因主要集中在外胚层发育(ectoderm development),表皮发育(epidermis development),上皮细胞的发育(epithelium development),上皮细胞分化(epithelial cell differentiation), C2型免疫球蛋白域1(domain:Ig-like C2-type 1), C2型免疫球蛋白域2(domain:Ig-like C2-type,免疫球蛋白(IPR013151:Immunoglobulin),细胞骨架结构组成(structuralconstituent of cytoskeleton),角质细胞分化(keratinocyte differentiation),表皮细胞分化(epidermal cell differentiation)方面。其中,外胚层发育(ectoderm development)方面相关的差异基因占总差异基因的12.10%,表皮发育(epidermis development)相关的差异基因占总差异基因的10.48%。然后,我们对118显著差异表达基因进行KEGG通路分析,以P-value<0.05,发现差异基因显著富集在抗原加工提呈(Antigen processing and presentation)和自然杀伤细胞细胞毒活性(Natural killer cell mediated cytotoxicity)两个方面。然后,我们对Patient#2患者耐药前SRR961667样本以及耐药后SRR961668样本,最终我们发现94个显著差异基因。然后,我们对这94显著差异基因进行功能注释分析。最终,我们发现显著差异表达基因主要富集在糖蛋白(glycoprotein),信号(signal),信号肽(signal peptide), N链接糖基化位点(glycosylation site:N-linked),细胞粘附(cell adhesion),生物粘附(biological adhesion),蛋白质的细胞外基质(proteinaceous extracellular matrix),细胞外基质(extracellular matrix),三聚体(trimer),胶原(collagen)方面。其中,有25个差异基因富集在糖蛋白(glycoprotein)方面,占糖蛋白(glycoprotein)包含基因的75.76%。有9个基因富集在细胞粘附(cell adhesion)方面,细胞粘附(cell adhesion)方面包含基因的27.27%。我们将118个显著差异基因进行KEGG通路分析。最终发现,在ECM受体交互作用(ECM-receptor interaction)和黏着斑(Focal adhesion)是显著富集的通路。COL6A3, COL1A1, COL5A1, THBS4与这两条通路密切相关。BRAF V600E突变的黑色素瘤患者患病后基因变化为了探究黑色素瘤BRAF V600E突变的患者与正常患者的区别,我们把SRR961663, SRR961665, SRR9616673例耐药前的患者与TCGA皮肤黑色素瘤正常样本RNA-seq对比。经过差异表达分析,我们发现274个基因表达差异显著。我们对这274差异表达基因进行了基因功能注释富集分析。在细胞组分方面,我们发现有一部分显著的富集均与核糖体相关。最显著的富集有27个基因富集在胞质核糖体(P=3.27E-28),34个基因富集在核糖体(P=2.59E-24),26个基因富集在核糖体亚基(P=2.59E-21),15个基因富集在胞质小核糖体亚基(P=3.38E.13)等。在细胞过程方面,我们发现差异基因主要最显著富集在翻译方面,有33个基因显著富集在翻译延伸(P=1.28E-35),37个基因显著富集在翻译(P=1.50E-22)。另外,我们还发现差异基因还富集在与免疫相关的方面。有39个显著富集在免疫反应(P=1.08E-13),有15个基因富集在抗原加工提呈(P=5.67E.12)。在细胞功能方面,我们发现有31个基因显著富集在核糖体的结构组成(P=4.67E-26),有40个基因显著富集在结构分子活性(P=1.30E-16),有27个基因显著富集在RNA绑定(P=1.73E-06)。我们还发现了MHC Ⅱ级受体的活动(P=3.43E-06)有6个基因显著富集。为了更好的理解差异基因的功能,我们对这274个差异基因进行了通路分析。我们发现有30个基因显著富集在核糖体(P=6.20E-27),有17个基因显著富集在抗原加工提呈(P=4.64E.11)。BRAF V600E突变黑色素瘤患者患病后及耐药后共同变化基因之前我们分析了正常至患病时基因表达的变化,同时我们也分析了患者患病后直到耐药后基因表达的变化。基因的表达变化伴随着疾病的进展时期的不同而不断变化着。为了观察由正常至患病再至耐药过程中最显著变化的基因,我们把两部分显著差异基因取交集。最终发现,在BRAF V600E突变的产生抗药性的患者耐药前后和BRAF V600E突变患者与正常的都发生差异的基因有9个, C1QC、CADPS、CD74、CLU、CORO1A、FMN1、HLA-DPA1、HLA-DRA、LSP1。我们同样的,对这些基因进行功能注释,发现这些基因主要显著的和免疫过程相关,免疫反应(P=1.21E-06)同时,我们也对这些基因做了通路分析,发现和抗原加工提呈(P=7.81E-04)相关。结论我们的研究对比了的BRAF V600E突变黑色素瘤患者耐药前后的RNA-seq数据,以及BRAF V600E突变黑色素瘤患者与正常患者基因表达的对比,筛选出每个阶段变化的差异基因,和两个阶段都变化的基因。我们通过功能注释和通路分析分析差异基因的功能,为BRAF V600E突变人群临床治疗提供帮助。RNA-seq技术提供了一个强有力的手段分析基因的表达情况。我们分析BRAF V600E突变黑色素瘤抗药患者耐药前后的RNA-seq数据。我们发现94个差异表达基因,62个基因上调,32个基因下调。我们对这些进行功能注释发现,在细胞组分方面,有25个基因与质膜相关,这给我们下一步的研究提供了一个可能的方向。已经有很多研究,质膜上的离子通道与癌细胞的增殖、分化、分泌、生存等众多生理活动相关。我们发现CACNA1C(P=5.00E-05)显著上调,而CACNA1C编码α-1蛋白调控在质膜上调控钙离子通道。有研究证实,钙离子通道蛋白与结肠癌,肺癌以及皮肤来源的原发性肿瘤相关,在正常的组织中几乎不能检测到。CACNA1C已经成为了一些癌症的用药靶点比如Magnesium Sulfate和Nicardipine。Magnesium Sulfate可以抑制肌细胞中的动作电位,降低收缩的频率和力量。Nicardipine是一个强有力的钙离子通道抑制剂,有明显的血管扩张作用和抗高血压特性,可以增强特定的抗肿瘤剂。同时,我们也发现SLC4A10(P=5.00E-05)这个基因显著下调。这个基因是SLC4跨膜家族载体成员,调节钠耦合碳酸氢转运(NCBTs),调节细胞内PH。肿瘤的特征不仅是无限度的增殖而且也改变肿瘤生长的环境,来促进肿瘤细胞无限的增殖和转移。而在肿瘤细胞中,细胞内部PH偏碱性(PH>=7.4),而在胞外环境中比正常细胞更偏酸性。SL4CA10的显著下调C1-/HC03-运输减少提示可能与黑色素瘤生长环境有关。我们使用BRAF V600E突变的黑色素瘤患者与正常样本基因表达的对比,发现了274个显著差异表达基因。我们在GO和通路分析的结果中发现很多富集在与免疫过程相关,特别是抗原加工和呈递过程。比如我们发现CD74,这个基因与MHC Ⅱ有关,是调节抗原呈递免疫反应过程的重要的分子伴侣,它也可以作为细胞表面受体抑制巨噬细胞移动。在之前的研究有表明,CD74编码的蛋白在黑色素瘤细胞中表达,而在良性黑色素细胞中不表达。目前,已经有药物,比如Milatuzumab,用于治疗针对肿瘤表达CD74抗原。在黑色素瘤疫苗的治疗过程中,抗原递呈起十分关键的作用。从广义来讲,肿瘤细胞也是一种抗原递呈细胞,通过胞质溶胶途径加工、处理肿瘤抗原,与MHCⅠ类分子形成复合物,并在细胞表面被CD8+T细胞识别,或者通过DC或巨噬细胞等专门的抗原递呈细胞通过溶酶体途径加工、处理肿瘤抗原,与MHCⅠ或11分子形成复合物在细胞表面被CD8+或CD4+T细胞识别。同时,我们也发现核糖体有关的过程也是很多基因显著富集的。核糖体的合成和对翻译的控制是细胞中必不可少的过程。目前已经有几个抑癌基因或者是原癌基因被发现可以影响核糖体的形成或者调节过程,虽然过程还不太清楚,但是这些基因有待我们进一步研究。我们发现在两个阶段同时都发生了变化的基因有9个,大部分的基因在两个阶段的变化不一致, 患处与正常相比下调,获得抗药性之后表达上调。我们从GO分析中发现CLU, C1QC, CD74, HLA-DRA显著富集在免疫过程中。C1QC已经成为众多药物的靶点基因。C1QC是人体补体成分C1Q的重要组成部分。现在已经有研究表明C1QA的缺失与红斑狼疮和肾小球肾炎有关。在临床上,已经有Tositumomab、Palivizumab、Cetuximab等针对C1QC的药物在使用。CLU基因目前也有研究发现与一些生物学事件有关,比如细胞凋亡、肿瘤的发展,还有神经退行性疾病有关。黑色素瘤的治疗是一个复杂的过程。我们在BRAF V600E突变的黑色素瘤抗药患者耐药前后的阶段发现显著质膜的变化；以及在BRAF V600E突变患者患病后免疫相关过程的基因的显著变化,为临床对黑色素瘤特异性治疗提供潜在的方向。然而,更多的发现仍然期待我们后续的对黑色素瘤的研究。