论文部分内容阅读
目的：本研究利用现代分子生物学技术构建用于转化变链菌的LuxS基因同源重组质粒载体，利用所构建质粒电转化变链菌以敲除变链菌中LuxS基因，构建LuxS基因缺失的变链菌突变株。采用哈氏弧菌生物荧光检测法对变链菌标准株和LuxS基因突变株的AI-2活性进行对比研究，为进一步研究AI-2信号感应系统对变链菌致龋毒力的调控机制奠定基础。方法：1．提取变链菌基因组DNA及红霉素抗性质粒PJT10，使用Premier5.0引物设计软件设计引物，通过嵌套式PCR的方法，分别扩增出变链菌LuxS基因的上、下游片段及质粒PJT10的红霉素抗性基因片段。2．将PCR所获得的3条片段依次采用相应的双酶切反应酶切后采用T4连接酶连接入载体质粒PUC19，按“LuxS上游序列～红霉素抗性基因～LuxS下游序列”的排列顺序连接，以构建目的质粒pUCluxKO重组载体。3．将突变载体电转化到含完整LuxS基因的突变受体S．mutans菌株中，红霉素抗性筛选出LuxS基因缺失的变链菌突变株，并经PCR和生物荧光检测法鉴定。4．分别培养变链菌和哈氏弧菌BB170，通过制备变链菌无细胞上清液，以新配制的TPY培养基为阴性对照，利用AI-2可以诱导哈氏弧菌报告菌株BB170发光的特性，检测变链菌标准株和突变株的无细胞上清液中有无AI-2信号分子，并对不同生长期变链菌上清液诱导发光强弱进行比较研究。结果：1．采用嵌套式PCR技术准确的克隆出LuxS基因的上下游片段和红霉素抗性片段，电泳鉴定可见扩增产物为较亮的单一条带，未见非特异性扩增及拖尾现象，分子量大小与预计大小相同。2．经酶切鉴定目的质粒各片段插入无误，插入片段测序显示碱基无错配，含目的质粒的大肠杆菌株可在红霉素抗性的LB培养基内生长良好，红霉素抗性基因可正常表达。3．PCR方法扩增突变株LuxS、Eym~r基因显示，LuxS基因已被完整敲除掉，证实筛选得到了LuxS基因缺失变链菌突变株。突变株不能诱导哈氏弧菌BBl70的生物发光，说明突变株不能再产生AI-2类信号分子。经连续培养20代后证实，变链菌突变株具有良好的稳定性。4．变链菌UA159的培养液过滤上清能够诱导AI-2报告菌株哈氏弧菌BB170发光，表明变链菌株中含有AI-2分子合成基因，从而提示变链菌中存在AI-2数量感应通路。而突变株不能诱导生物发光，说明LuxS基因成功敲除。结论：本研究利用AI-2诱导发光检测法对变链菌培养上清液检测，表明变链菌中含有群体感应信号分子AI-2的合成基因LuxS。采用嵌套式PCR扩增所需基因片段较传统的PCR准确性更高，避免对带有酶切位点的引物空间结构干扰而致的非特异扩增，提高了扩增的效率和准确性。本研究所构建的变链菌LuxS基因同源重组克隆载体正确，红霉素抗性片段表达良好。通过电击转化法成功构建出变链菌LuxS基因缺失突变株，为下一步研究LuxS基因对变链菌致龋性的影响奠定基础。