双光子激发在生命科学研究中具有十分重要的地位。相比单光子激发,双光子激发具有很多天然的优势。首先,其采用更长的激发波长,因而在生物组织中具有更大的穿透深度。其次由于双光子激发是非线性过程,需要更高的光子密度才能发生。因此其激发具有空间约束性,大大减少了焦外激发,具有良好的光学切片能力。系统中较少的焦外激发,较低的光子能量,进一步减少了光漂白和光损伤,提升了组织的存活时间,这对长时间的生物成像来讲十分重要。此外,双光子激发波长和荧光波长在光谱上相距较远,因此更容易实现激发光和荧光信号的分离。双光子荧光显微以其众多的优势被广泛应用于生物医学领域的研究中。然而,现有的双光子显微技术仍然存在分辨率不够高,视场不够大等问题和不足。进一步提升系统性能依然具有重要的意义。本论文根据非线性光学理论,点扩散函数工程,荧光差分方法以及光瞳分割扫描方法,对双光子激发显微成像中的方法和技术进行了深入的研究。旨在进一步提升系统的分辨率、视场和时间分辨率,使其在生命科学研究中获得更为广泛的应用。本文的主要内容及创新点如下:1.深入研究了荧光差分方法和荧光饱和效应对双光子显微系统成像分辨率及对比度的影响。对相关内容进行了理论分析和仿真计算,并首次构建了双光子荧光差分显微系统。相关实验结果证明了本方法可以将双光子显微系统的成像分辨率提升至百纳米量级并改善成像对比度。2.将并行探测和像素重组引入双光子显微中。对像素重组理论及算法在双光子显微成像中的应用进行了仿真计算和实验验证。光纤束中光纤为环形排列,外围轮廓的光纤偏离了系统光轴,可以获得更高频率的信息,提升成像分辨率。设计并搭建了具有反向扫描探测光路的双光子显微成像系统,对并行探测所获取的信息进行处理,获得了分辨率及对比度的提升。采用并行探测结合像素重组算法,只需要一次成像,就可以在保证系统成像速度的前提下提升成像质量。3.深入研究了使用轴向荧光差分方法提升双光子显微轴向分辨率的方法并构建了相应的成像系统。该系统通过对成像光束进行相位调制得到轴向分裂的点扩散函数,通过荧光差分的方法成功提升系统的轴向分辨率,提升了系统的光切片能力。4.深入研究了飞秒脉冲固有短相干长度对全息双光子激发的视场限制问题。通过光瞳分割扫描的方法,对空间光调制器(Spatial Light Modulator,SLM)上的像素进行充分的利用,利用振镜对多个全息图进行快速的读出和传送,在1.3毫秒的时间内实现了 1.3毫米视场的双光子激发。该方法具有可扩展性,与神经科学研究中常用的双光子激发光源和成像系统兼容。