研究背景近年来随着医源性气管狭窄、复杂性气管损伤、原发和继发性气管肿瘤发病率的增加,临床上需要进行气管重建的病人也随之增多。目前气管重建的方法有很多,但均存在各种问题。其中同种异体气管移植可以在气管组织结构和功能方面进行重建,能克服气管重建过程中的大部分问题,因此具有较好的临床应用前景。而由闭塞性气道疾病(Obliterative Airway Disease,OAD)引起的气管移植体纤维瘢痕狭窄是同种异体气管移植手术的主要术后并发症,也是制约气管移植在临床上广泛应用的主要原因。上皮间质转化(Epithelial to Mesenchymal Transition,EMT)指上皮细胞在细胞生物学上表现为失去其自身的上皮细胞特性而获得间质细胞的表型,在分子生物学上表现为上皮细胞固有的标志物表达水平降低,间质细胞相关的标志物表达水平增高,以及与EMT有关的转录因子发生了激活。根据文献报道,EMT这一现象在生物组织的胚胎发育、恶性肿瘤的侵袭以及组织的纤维化过程中广泛存在。由于同种异体气管移植后,其典型的特征就是狭窄的移植体管腔内有大量的纤维结缔组织生成,而且也有研究表明,人原代支气管上皮细胞在转化生长因子β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)作用下,可以发生EMT,据此我们推断,EMT很有可能是导致气管同种异体移植体发生狭窄的一个重要因素。此外还有研究表明,气管内上皮组织的完整程度与气管管腔狭窄程度呈负相关,即气管内上皮组织的完整程度越低,移植后气管移植体的狭窄程度也越高,这说明供体气管上皮细胞的损伤,可以最终导致气管移植体的狭窄。但对于气管上皮细胞的损伤,是否可以通过诱导EMT从而导致移植体狭窄,目前所知甚少;而植入受体源性的气管上皮细胞,是否能抑制EMT从而缓解移植体狭窄,也仍然未知。目的本研究课题的目的在于明确气管上皮细胞在同种异体气管移植体狭窄中扮演的角色,以及阐明气管上皮细胞植入抑制同种异体气管移植体发生狭窄的可能分子生物学机制,为临床上预防和治疗同种异体气管移植体狭窄提供新的思路。方法(1)采用Accutase酶消法分离Wistar大鼠原代气管上皮细胞并加以培养。(2)建立SD-Wistar大鼠同种异体皮下异位移植模型,SD-SD大鼠同系异体皮下异位移植模型,以及SD-Wistar大鼠受体源性上皮细胞植入同种异体皮下异位移植模型(在移植后第6天植入Wistar大鼠原代气管上皮细胞)。然后在移植后第7、14、30天,处死各组实验大鼠,取出气管移植体,一部分用于石蜡包埋,另一部分提取总RNA和提纯总蛋白。然后石蜡切片后行苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin,H&E)染色,用病理图像分析系统检测移植体气管上皮细胞覆盖比率、气管管腔狭窄和炎性细胞浸润程度。(3)石蜡切片后行免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)染色,检测上皮细胞标志物E-cadherin以及间质细胞标志物vimentin的表达以及定位。提取总蛋白后行Western Blot检测,半定量分析E-cadherin和vimentin的表达。(4)提取总RNA,并反转录成c DNA,实时定量聚合酶链反应(Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction,q RT-PCR)检测EMT相关转录因子ZEB1、ZEB2、Snail1、Snail2、Twist1的m RNA表达水平,并进一步实施Western Blot以检测ZEB1的蛋白表达水平。(5)q RT-PCR检测TGF-β信号通路相关分子的表达水平,包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3以及转化生长因子β1受体(Transforming Growth Factor-βReceptor1,TGFBR1)的m RNA表达,以及Western Blot检测smad3和p-smad3的蛋白表达。结果(1)摸索出Accutase酶消法分离大鼠气管上皮细胞的最佳培养条件,成功地培养了Wistar大鼠原代气管上皮细胞。(2)成功建立了大鼠气管背部皮下异位移植模型。组织病理学检测发现,同系异体移植物组织病理结构基本接近正常,而同种异体移植物气管纤毛上皮细胞数量逐渐减少,管腔狭窄和炎性细胞浸润程度也逐渐加重。当植入受体源性的气管上皮细胞后,气管纤毛上皮细胞数量得到了恢复,管腔狭窄和炎性细胞浸润程度也得到了缓解。(3)IHC检测发现E-cadherin主要在上皮细胞中表达,而vimentin主要在间质细胞中表达。同系异体移植物E-cadherin表达量很高,而同种异体移植物E-cadherin表达量逐渐降低,植入受体源性的气管上皮细胞后,E-cadherin的表达量有所回升。而vimentin的表达刚好和E-cadherin的表达相反,这一表达趋势在Western Blot检测中得到了验证。(4)q RT-PCR检测EMT相关转录因子的表达改变情况,与同系异体移植物相比,同种异体移植物中EMT相关转录因子(ZEB1、ZEB2、Snail1、Snail2、Twist1)表达水平都有所增高,其中ZEB1的增高最为明显。而植入受体源性的气管上皮细胞后,可以抑制EMT相关转录因子的表达,其中对ZEB1抑制作用最为明显,这一结论也在Western Blot检测中得到了验证。(5)检测了TGF-β信号通路相关分子的表达情况,与同系异体移植物相比,在同种异体气管移植物中TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3表达均增高(其中TGF-β1的表达增高最为明显),TGFBR1表达水平也相应增高,而且smad3的磷酸化水平也有所增高。当植入受体源性的气管上皮细胞后,TGF-β1和TGFBR1的表达水平降低,smad3的磷酸化水平也相应降低。结论(1)建立同种异体气管异位移植动物模型后,供体气管上皮细胞会发生损伤,气管管腔会发生狭窄和梗阻;(2)受体源性的气管上皮细胞植入,可以抑制大鼠同种异体气管移植体发生狭窄;(3)气管上皮细胞损伤激活的TGF-β-Smad信号通路可能是导致其发生EMT以及移植体发生狭窄的重要分子学机制;(4)受体源性的气管上皮细胞植入,可以通过抑制TGF-β-Smad信号通路来缓解EMT,从而减轻大鼠同种异体气管异位移植后管腔狭窄程度。