随着经济的发展,近年来,山东省毛皮动物养殖业发展迅速,目前已成为我国毛皮动物养殖第一大省,毛皮动物饲养量约占全国的二分之一。但是随着我省毛皮动物养殖业集约化程度的提高,毛皮动物的发病率持续上升,疫病防控形势日趋严峻,疫病成为制约毛皮动物产业发展的重要因素,给毛皮动物养殖业造成了很大的经济损失。水貂出血性肺炎是严重妨碍水貂养殖业的重要疫病之一,且疫情日趋严重。绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa)又称铜绿假单胞菌,是引起水貂出血性肺炎的病原之一,为了有效的防控水貂出血性肺炎,应揭示阐明绿脓杆菌对水貂的致病性。本研究采用常规细菌分离鉴定技术,对43份患出血性肺炎的水貂肺组织进行了绿脓杆菌的分离鉴定,同时选择绿脓杆菌代表菌株,建立绿脓杆菌致病性研究动物模型,来阐明绿脓杆菌的致病性。1.绿脓杆菌的分离鉴定2013年,在山东省诸城、文登、临沂等地采集了43份患出血性肺炎的水貂肺组织。通过常规细菌分离技术对这43份病料进行了细菌分离培养,并采用形态学观察、生化试验、药敏试验与16SrDNA测序等方法,对分离到的细菌进行鉴定。结果,分离到的5株细菌,均为绿脓杆菌,分别命名为F1、F5、F6、F8、F10,分离率为11.6%。药敏试验结果表明,5株绿脓杆菌均对青霉素、红霉素、卡那霉素耐药。16SrDNA序列同源性分析结果表明,5株绿脓杆菌与14株参考菌株间的核苷酸同源性为80.9%~100%,5株绿脓杆菌之间的核苷酸同源性为98.9%~99.7%;系统发育分析显示,F5、F6、F8、F10与F1均在同一个大的分支上。2.貂源绿脓杆菌的致病性研究首先以F1株作为代表菌株,对小鼠进行腹腔接种,建立绿脓杆菌对小鼠的致病性研究动物模型。将30只健康小鼠随机分成6组,隔离饲养,每组5只。第1-5组小鼠分别腹腔接种菌落数为6.4×107CFU、6.4×106CFU、6.4×105CFU、6.4×104CFU、6.4×103CFU的F1菌液,第6组小鼠作为阴性对照。攻毒后对实验小鼠连续观察7天,记录小鼠的临床症状,对在实验期间死亡的小鼠进行剖检,采集心、肝、脾、肺、肾进行细菌的分布检测及病理组织学检查。结果,第1、2组小鼠在接种后12h-18h内全部死亡,小鼠的心、肝、脾、肺、肾均有不同程度地出血,尤以肺部病变更为严重;病理组织学检查可见小鼠心肌出血、肝细胞坏死、脾脏有大量炎性细胞、肺脏出血、肺泡壁增厚、肾间质有红细胞;在上述器官中均分离到了绿脓杆菌,在小鼠肺部含量最高,脾脏中含量最低;测得F1对小鼠的LD50为1.6×106CFU/mL。小鼠致病性试验结果表明绿脓杆菌对小鼠具有较强的致病力。以F1株作为代表菌株,对水貂进行鼻腔接种,建立绿脓杆菌对水貂的致病性研究动物模型。将20只健康3月龄水貂分成5组,隔离饲养,每组4只。第1-4组分别鼻腔接种菌落数为1.6×108CFU、1.6×106CFU、1.6×104CFU、1.6×102CFU的F1菌液,第5组水貂为阴性对照,攻毒后连续观察14天,对实验期间死亡的水貂和实验结束时扑杀的所有水貂进行剖检,采集其心、肝、脾、肺、肾进行病理组织学检查及细菌分离。结果,第1组水貂在人工感染后20h-44h内全部死亡,剖检可见死亡水貂的肺部严重出血、脾脏肿大,在其心、肝、脾、肺、肾中均分离到了绿脓杆菌。病理组织学检查可见心肌纤维出血、肝细胞变性、脾脏出血坏死、肺出血、间质增厚。测得F1对水貂的LD50为3.2×107CFU/mL;其他人工感染组在接种后的第1-3d表现精神不振、食欲下降等临床症状,但自攻毒后第4d恢复正常,直至实验结束,病理组织学观察未见异常,也均未从相关脏器中分离到绿脓杆菌。实验结果表明,绿脓杆菌能够感染水貂并引起发病,但致病性不强,应该还有其他引起水貂出血性肺炎的病因。本研究阐明了绿脓杆菌对水貂的致病性,为水貂出血性肺炎的防治提供了实验数据,奠定了理论基础。