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褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronate,M）及其C5差向异构体α-L-古洛糖醛酸（α-L-guluronate,G）两种糖单元随机排列组成的一种线性多糖。褐藻胶寡糖具有抗凝血、降血糖、抗肿瘤、促植物生长等多种生物活性,其生物活性受糖单元序列组成、聚合度大小及分子修饰特征等显著影响。酶法制备褐藻胶寡糖具有反应条件温和、特异性强、污染小、可控性强等优点,是化学法与物理法的潜在替代技术,因此应用价值明确的工具型褐藻胶裂解酶的开发是制备大小均一、含特定结构寡糖片段的重要基础。褐藻胶裂解酶是一类多糖裂解酶,通过β消去反应催化糖苷键的断裂,从而生成含不饱和末端结构的低聚糖。与外切型褐藻胶裂解酶不同,内切型褐藻胶裂解酶彻底降解褐藻胶后可产生系列大小结构特定的不饱和寡糖产物,因此在寡糖制备中具有更明确的应用价值。目前,关于褐藻胶裂解酶的资源发掘、生化特征与分子改造等相关研究较多,但其中关于酶的底物选择性、底物降解模式与寡糖生成特性的研究较少。目前,仅见如Flammeovir sp.MY04来源的G-专一性内切酶Aly5、G-倾向性双功能内切酶Aly1和Aly2、Wenyingzhuangia fucanilytica来源的M-倾向性双功能内切酶Aly7BWf,以及Pseudomonas aeruginosa和Azotobacter vinelandii来源的 M-专一性内切酶Pae-AlgL和Avi-AlgL的系统分析。整体上,关于M-专一性内切酶的催化特性及相应机制的深入研究相对较少,因此缺少规律性的机制与认知,给定向分子酶学改造带来困难。本文通过分析海洋来源的高效多糖降解菌桃色杆菌（Persicobacter sp.）JZB09的全基因组序列,从中筛选到一个候选褐藻胶裂解酶基因ORF06925,结合生物信息学分析、基因的重组表达、蛋白质纯化以及基因截短、定点突变等分子改造,比较分析了酶及其系列突变体的底物选择性、底物降解模式、寡糖产物生成特性及催化机理等方面的差异,所得结果如下:1、生物信息学分析表明:Aly06925由399个氨基酸组成,只含有一个功能模块;在已鉴定的酶中,全长蛋白与褐藻胶裂解酶（Azotobacter vinelandii来源的PL-5家族的AlgL）氨基酸序列的相似性最大,为9%。系统发育树分析表明,Aly06925虽然与PL-5或PL-17家族成员亲缘关系较近,但单独成支,与目前已鉴定的所有家族成员均不聚类,因此应归类于一个未见报道的多糖裂解酶新家族。2、生化特性分析表明:用pET30a构建重组表达载体pET30a-Aly06925,其产物-重组酶rAly06925最适反应温度是35℃,最适pH为pH6.0,具有一定的温度稳定性（0-20℃）和 pH 稳定性（pH7-8）。1 mM Ca2+、1 mM DTT 和 0.2 M NaCl均对酶具有显著促进作用,最高可使其活性分别提高至120%、131%、160%。关于重组酶rAly06925的主要新颖点包括:1、阐明了 M-专一性褐藻胶内切酶的寡糖生成特性。即:重组酶rAly06925彻底降解褐藻胶多糖后,最终主产物中含量最高的是不饱和二糖（23.1%,w/w）、三糖（23.1%,w/w）和四糖（23.1%,w/w）片段,含有部分不饱和五糖（19.2%,w/w）和不饱和六糖（11.5%,w/w）。通过分子凝胶色谱层析获得系列大小的高纯度寡糖产物片段,然后对其进行氢谱分析,结果表明上述系列大小的寡糖终产物的非还原端均为ΔM单元,均不含有ΔG单元。这与本课题组已报道的G-专一性内切酶Aly5、G-倾向性双功能内切酶Aly1和Aly2、M-专一性内切酶Pae-AlgL和Avi-AlgL的寡糖终产物结构特征及其演替规律都显著不同,即该酶的系列寡糖终产物从二糖到更大的寡糖不具有由ΔG向ΔM或者由ΔM向ΔG逐渐演替的规律,而是单一的ΔM型非还原末端。因此,本文Aly06925是专产仅含ΔM末端系列不饱和寡糖终产物的首个褐藻胶裂解酶,工具性特色显著。2、为进一步揭示决定该酶具有上述寡糖生成特性的相应机理,本文进行了深入研究,结果表明Aly06925的寡糖生成特性由底物选择性和底物降解模式共同决定。具体说明如下:（1）底物选择性:rAly06925能够显著降解系列饱和聚M段寡糖,但对G系列饱和寡糖几乎不降解,因此该酶M-专一性显著。（2）底物降解模式:重组酶rAly06925降解天然饱和寡糖M5主要生成M2和UM3,而降解M4主要生成M和UM3;降解人工合成饱和寡糖2AB-M5主要生成M2和2AB-UM3,而降解2AB-M4主要生成M和2AB-UM3;不完全降解天然不饱和寡糖UDP6主要生成UDP2、UDP3、UDP4,微弱降解UDP5主要生成UDP4和不饱和单糖（Δ）。因此,褐藻胶裂解酶Aly06925的最小寡糖底物包括天然饱和四糖M4、不饱和五糖UDP5及人工合成的寡糖底物2AB-M4,最小寡糖产物则包括饱和的单糖M或不饱和的单糖Δ。此外,重组酶rAly06925在降解寡糖底物时,较小的寡糖产物均产自底物的非还原端,且酶在降解较小的饱和型寡糖底物（M4/M5、2-AB-M4/M5）时,饱和寡糖产物的大小随底物糖链聚合度的增大而相应增大,且仅在降解较小的寡糖底物（M4、UDP5）时产生单糖产物（M、Δ）。这表明,褐藻胶内切酶Aly06925具有可变的底物降解模式。综上,结合酶的底物选择性、最小底物和最小产物及其结构特征,本文推测该酶专产ΔM末端系列不饱和寡糖终产物的机理为:重组酶rAly06925在降解由M、G随机混合组成的褐藻胶多糖时,只能专一性识别M-MMXn、G-MMXn或Δ-MMXXn等富含M的基序,并高效切割其中-所示糖苷键位置（X,M或G;聚合度n≧1,自然数;以下同）,从而生成非还原末端仅为ΔM的系列不饱和寡糖终产物。但是,该酶不能识别褐藻胶中的G-GGXn、M-GGXn或者Δ-GGXn等富含G的基序,且不能切割其中-所示的糖苷键（X,M或G;聚合度n≧1,自然数;以下同）,因而不可能产生非还原末端为ΔG的系列不饱和寡糖产物。3、一级序列分析发现褐藻胶裂解酶Aly06925含有与PL-5家族成员的催化基序（NNHSYW）半保守的两个潜在催化基序（N113-N114-H115-T116-D1 17-F118和N238-N239-H240-G241-T242-H243）,但无法直接令人信服的预测哪一个在催化降解过程中起关键作用。模块构成分析表明褐藻胶裂解酶Aly06925只含有一个潜在催化结构域（V66-W345）;三维结构模拟发现Aly06925整体呈套筒形状,主要由α-螺旋组成,具有一个隧道状催化腔,这与Pseudomonas aeruginosa和Azotobacter vinelandii来源的PL-5家族AlgL相似。但相比之下多出一个额外肽段（K45-N60）,构成α-螺旋,功能未知。因此,本文结合分子截短与定点突变研究,比较并分析了酶Aly06925及其系列突变体的酶学性质。结果表明:在褐藻胶裂解酶Aly06925中,两个与 PL-5 家族NNHSYW 保守的潜在催化基序中的N238-N239-H240-G241-T242-H243 是催化基序,而 N113-N114-H115-T116-D117-F118 不是催化基序;Y87,Q170,H240,Y295 等是关键的催化位点残基;与 Pseudomonas aeruginosa和Azotobacter vinelandii来源的 AlgL 相比,截除 Aly06925 的额外肽段 K45-N60或将Y244突变为A244均导致重组蛋白质丧失水溶性,因此,额外肽段K45-N60及其所含Y244残基对维持蛋白质构象或决定蛋白质表面的亲水性具有关键作用。综上所述,多糖高效降解菌Persicobacter sp.JZB09来源的M-专一性褐藻胶内切酶Aly06925序列新颖,应归类于未见报道的多糖裂解酶新家族。本文的研究表明,褐藻胶裂解酶Aly06925的寡糖生成特性也是由底物选择性与底物降解模式共同决定的,特色之处在于Aly06925的底物选择性高度专一,因此降解褐藻胶时专产仅含ΔM末端的系列不饱和寡糖终产物,M-专一性内切酶的工具性价值及其催化机理的研究在国内外未见同类报道。本文还为新颖褐藻胶裂解酶在关键位点的筛选及鉴定上提供了一定的理论和系统的技术支撑,对新型褐藻胶裂解酶家族及其保守基序的认知进行了有效的补充,有待于结构生物学研究加以详细鉴定。