无标记生物分析技术是近年来新兴发展的一类分析新技术,其无需繁琐复杂的标记过程,能够实现对生物样品的直接测定,具有流程短、速度快、成本低和操作简单等优势,已成为分析领域一个新的发展趋势。微流控纸芯片是近几年发展起来的一种基于纸的微流控分析技术平台。微流控纸芯片集成了进样、反应、检测等一系列操作,具有成本低廉、便携、操作简便、试剂消耗少、分析速度快、生物相容性好、可多元检测等优点。微流控纸芯片作为一种微全分析系统,为无标记生物分析技术提供了有效的检测平台。本论文围绕开发新型无标记生物分析技术和构建基于微流控纸芯片的无标记多元分析检测体系,开展以下研究:开发了一种新颖、简单、快速、灵敏、低成本的无标记比色分析方法,实现对还原型谷胱甘肽（GSH）相对于其类似物半胱氨酸（Cys）和同型半胱氨酸（Hcy）的高选择性测定。本实验中,邻苯二胺（OPD）可被银离子（Ag⁺）氧化,生成银纳米颗粒（AgNPs）和淡黄色2,3-二氨基吩嗪（简称OPDox）,OPDox的紫外吸收峰中心为429 nm。生成的AgNPs能进一步催化OPD与Ag⁺之间的氧化还原反应。在GSH存在下,GSH可与Ag⁺发生螯合作用,从而抑制了Ag⁺的氧化能力。GSH还可与AgNPs发生相互作用,抑制AgNPs对上述显色反应的催化能力。此外,GSH还能将氧化型有色产物OPDox还原,最终导致检测体系褪色,紫外吸收强度降低,从而实现GSH的无标记、选择性测定。所提出的基于Ag⁺-OPD显色反应的传感体系,可实现GSH从2 nM到1μM宽线性范围的检测,检测限低至1.7 nM。该方法还被成功应用于血浆和尿液中谷胱甘肽的检测,检测结果理想。设计了一种具有化学发光时间分辨检测性能的双层三维微流控纸芯片。该微流控纸芯片以层析滤纸作为亲水基底,石蜡为疏水涂层,使用丝网印刷技术制备出亲疏水三维微流控通道。所制备的三维微流控纸芯片结构紧凑,具有一个进样区和多个检测区。使用鲁米诺-H₂O₂化学发光体系进行测试,其在化学发光动力学曲线上得到了四个分离良好的化学发光峰,其分离度高达20左右,具有优异的化学发光时间分辨检测性能。所制备的化学发光时间分辨检测型微流控纸芯片,为实现多物质同时检测提供了良好的检测平台。基于设计制备的化学发光时间分辨型三维微流控纸芯片,构建了一种无标记化学发光多物质同时检测体系,成功实现了对葡萄糖、乳酸、胆固醇和胆碱的同时测定。该检测体系,首先通过壳聚糖将化学发光催化剂钴离子和不同氧化酶固载修饰于四个检测区,加入目标分析物后,目标分析物在其特异性氧化酶的催化下,自发发生氧化反应,从而在各检测区定量生成H₂O₂。将鲁米诺溶液从三维微流控纸芯片的进样区加入微流控纸芯片后,鲁米诺溶液依次迁移至四个检测区,在钴离子催化下,与检测区的H₂O₂发生氧化反应,发生时间分辨型化学发光信号。基于化学发光动力学曲线中产生的四个化学发光峰的强度,分别实现对葡萄糖、乳酸、胆固醇和胆碱的定量检测。所构建的无标记分析方法可实现葡萄糖、乳酸、胆固醇和胆碱的同时测定,其检测范围如下:葡萄糖（0.01-1.0 mM/L）、乳酸（0.02-5.0 mM/L）、胆固醇（0.01-0.4 mM/L）和胆碱（0.001-1.0 mM/L）,检测限分别为8μmol/L、15μmol/L、6μmol/L和0.07μmol/L。所制备的多物质同时检测型微流控纸芯片,在生命分析、临床领域具有巨大的应用潜力。