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研究目的：阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是老年人常见的,以记忆力减退、认知功能障碍、人格改变为主要特征的中枢神经系统变性性疾病,以神经细胞内出现神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle, NFT)、老年斑(senile plaques, SP)、大脑皮质和海马等部位神经细胞减少等为主要病理特点。其发生机制目前尚未完全阐明。但大多研究报道老年炎性斑内的大量β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein, Aβ)沉积在其发病机制中起到重要作用。而Aβ的神经毒性机制也极其复杂,与过度氧化应激、Ca2+的超载、谷氨酸浓度的增高等有着一定的关系。Aβ1-42是p-淀粉样蛋白的主要存在形式。已有研究表明Aβ1-42更易发生聚集、沉积且难溶解,从而能够改变Na+-K+-ATP酶和乙酰胆碱的活性,使神经细胞凋亡。脑组织中的Na+-K+-ATP酶存在于细胞膜上,通过水解ATP逆化学梯度转运离子,维持神经细胞兴奋传导和细胞内环境的物质基础。Na+-K+-ATP酶主要由α、β亚基组成的二聚体,α亚基是催化酶反应的亚基；β亚基是一个分子量近60kDa的高度糖基化质膜蛋白,具有组织选择性。目前α亚基研究较多,而研究Na+-K+-ATP酶的调控亚基p亚基较少。但有研究表明,Na+-K+-ATP酶p亚基的表达及组织结构适应性强。Na+-K+-ATP酶活性的变化有赖于Na+-K+-ATP酶p亚基mRNA的表达调控,也是维持Na+-K+-ATP酶稳定性以及膜正确定位的必要组成部分。过度氧化应激与自由基毒性作用在AD的发病中起着重要作用。Ap产生大量的自由基,可直接氧化酶蛋白氨基酸残基,使酶失活。影响Na+-K+-ATP酶活性,引起神经细胞内Na+的聚集,K+的流失,细胞的离子失衡,内环境的紊乱。ATP敏感钾通道(ATP sensitive potassium channels, KATP通道)是与细胞代谢状态密切相关的离子通道,通过感受细胞内ATP/ADP水平的变化,直接将细胞代谢状态与电活动相偶联。已有研究表明单唾液酸四已糖神经节苷脂(monosialotetrahexosyl ganglioside, GM1)可以通过维持中枢神经细胞膜上的Na+-K+-ATP酶的活性,起到维持细胞内外离子平衡、减轻神经细胞水肿、防止细胞内Ca2+聚集的作用；还可以对抗兴奋性氨基酸的神经毒性作用,减少自由基对神经细胞的损害,起到神经保护作用。而ATP敏感钾通道(ATP sensitive potassium channels, KATP通道)开放药物二氮嗪可降低Ap寡聚体聚集,用二氮嗪预处理能够抵抗Aβ1-42的神经毒性。而二氮嗪的预处理是否影响Ap对Na+-K+-ATP酶p亚基蛋白的表达,目前尚未报道。因此,本研究旨在探讨二氮嗪预处理如何影响Aβ1-42对神经细胞Na+-K+-ATP酶p亚基蛋白的表达。研究方法：本实验选用Wsitar大鼠新生24h的胎鼠,进行大脑皮层海马神经细胞原代培养的方法。随机分为4组：对照组、单纯Aβ1-42干预组、二氮嗪预处理1h后Aβ1-42干预组、单纯二氮嗪预处理组,每组又分为24h及72h两个亚组。每组药物干预方法为：二氮嗪预处理1h后Aβ1-42干预组：加入二氮嗪(50μmol/L)预处理神经细胞1h后加入Aβ1-42 (2μmol/L)作用；单纯Ap1-42干预组加入等量的磷酸盐缓冲液预处理1h后,加入等量Aβ1-42；单纯二氮嗪预处理组为加入二氮嗪预处理1h后加入等量培养液；对照组加等量磷酸盐缓冲液和培养液。采用免疫荧光及Western blot检测各组Na+-K+-ATP酶β亚基的蛋白表达。研究结果：(1)用免疫荧光化学染色结果显示：绿色为Na+-K+-ATP酶β亚基。研究说明Na+-K+-ATP酶β亚基在皮层及海马神经元上是有表达的。(2)免疫荧光显示：Aβ1-42作用细胞72h降低了Na+-K+-ATP酶p亚基荧光强度；而经二氮嗪预处理1h后Aβ1-42作用72h,与单纯Aβ1-42组相比较荧光强度有所增强。(3) Western blot显示：二氮嗪预处理神经细胞1h协同Aβ1-42作用24h后及单独二氮嗪组Na+-K+-ATP酶p亚基的蛋白表达明显低于对照组及单纯Aβ1-42组(P<0.01)。Aβ1-42作用神经细胞72h后,Na+-K+-ATP酶p亚基蛋白表达较对照组显著降低,并有统计学意义(P<0.05)；二氮嗪预处理1h协同Aβ1-42共同作用于神经细胞72h后,与单纯Aβ1-42组相比较,增加了Na+-K+-ATP酶p亚基蛋白表达量,并有统计学意义(P<0.05)。研究结论：(1)Aβ1-42作用72h,Na+-K+-ATP酶β亚基蛋白表达与对照组相比较,明显下降。提示Aβ对Na+-K+-ATP酶β亚基是有影响的。(2)Aβ1-42作用细胞72小时同时采用二氮嗪预处理,免疫荧光和蛋白电泳实验结果均发现：二氮嗪拮抗了Aβ1-42降低Na+-K+-ATP酶p亚基蛋白表达的作用。而Aβ1-42和二氮嗪共同作用24小时,并没有明显地影响到Na+-K+-ATP酶p亚基的生理作用。(3)24h和72h蛋白电泳显示单独应用二氮嗪明显降低了Na+-K+-ATP酶β亚基的蛋白表达水平。研究意义：Na+-K+-ATP酶β亚基蛋白可能参与阿尔茨海默病的发生发展过程,为研究防治AD药物提供新靶点。