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头孢氨苄(Cephalexin,CEX)属于β-内酰胺类抗生素(β-lactam antibiotics),开发距今已五十载,由于其抗菌谱广、吸收效果好、价格低廉,在人类医学和兽医临床上一直有很广泛的应用。但是,在细菌耐药性日趋严重的今天,头孢氨苄等抗生素残留问题必须得到重视。目前,中国、美国、英国、欧盟等多个国家或组织都已对头孢氨苄最大残留限量做出标准规定。检测分析手段的提高是应对抗生素残留必不可少的关键。检测头孢氨苄残留的方法主要有微生物检测法(包括TTC法、扩散法等)、仪器检测法(包括UV-Vis、HPLC、LC-MS等)和免疫学检测法(包括ELISA、FPIA、IC等)。微生物法特异性不强、灵敏度不高,而且易受到其他条件干扰,已无法满足当前实际工作中快速、准确的检测要求;仪器分析法灵敏度高、重复性好、特异性强,但昂贵的实验仪器、复杂的前处理过程、操作繁琐的方法步骤是制约该法广泛应用的重要因素;免疫学检测法特异性强、灵敏度高、操作简单、耗时少,但假阳(阴)性率高、重复性较差却是这种方法的局限性。目前来看,将免疫学方法与仪器检测法联合使用是一种科学、合理、高效的检测分析思路。将免疫学方法作为前期工作初筛方法,仪器分析法作为后期确证方法,这不仅可大规模快速筛选,而且也能保证检测结果的可靠性。本研究旨在制备出亲和力高、特异性强的抗头孢氨苄单克隆抗体,以期建立快速、简便、准确的免疫学检测方法,为我国头孢氨苄在动物性食品中残留监控提供理论和技术支持。研究包括以下四点内容:1、头孢氨苄人工抗原的合成与鉴定。利用偶联剂戊二醛将头孢氨苄与载体蛋白(BSA、OVA)偶联,分别制备免疫抗原CEX-BSA和包被抗原CEX-OVA。经紫外分光光度法、SDS-PAGE凝胶电泳和免疫学方法,鉴定人工抗原的合成是成功的。2、抗头孢氨苄单克隆抗体的制备与鉴定。利用单克隆抗体技术,将受免小鼠B淋巴细胞与SP2/0融合,通过有限稀释法和CiELISA筛选得到2株单克隆细胞株(2B4、5B3),并将其注入小鼠腹腔,得到腹水型单克隆抗体。经Protein G HP亲和层析柱纯化后鉴定,2G4单克隆抗体效价高于1:1.28X 105,其抗体亚型为IgG2b(κ轻链),抗体亲和力常数为K=1.51×109L/mol,抗体除了与头孢拉定有52.55%的交叉反应率,与头孢噻呋、头孢曲松、头孢噻肟、头孢噻吩、青霉素、链霉素、四环素等药物均无明显交叉反应,说明制备的抗体亲和力高、特异性较好,为后续免疫学检测方法的建立打下了良好的基础。3、鲜奶中头孢氨苄ELISA检测方法的建立。本章研究中排除了鲜奶基质干扰影响,并优化了封闭液的成分和浓度,摸索了 2G4单克隆抗体与包被抗原CEX-OVA的最佳工作浓度,所绘制的标准抑制曲线线性关系良好R2=0.9909,在20～1000 ng/mL药物浓度范围里,线性方程为y=0.4674x-0.5359,IC50为 163.55 ng/mL,LOD为19.68ng/mL。通过对样品的添加回收实验发现,该方法检测灵敏度较高,样品回收率在83.98%～102.92%之间,平均回收率为91.31%;变异系数在8.50%～14.5%之间,平均变异系数为10.75%,符合我国规定的头孢氨苄在牛奶中最大残留限量标准,具有一定应用价值。4、头孢氨苄胶体金免疫层析试纸条的研制。采用柠檬酸三钠还原法制备不同粒径胶体金,摸索制备金标抗体的最佳pH和最适单抗标记量,摸索金标垫中金标抗体结合量,优化NC膜中C线(羊抗鼠IgG)与T线(CEX-OVA)喷涂量,优化了 NC膜封闭液成分,并对试纸条稳定性、灵敏度、特异性进行鉴定。结果显示:金标抗体最佳pH为8.4,最佳单抗标记量为每200 μL胶体金溶液中加入9 μL单抗;金标垫中金标抗体以稀释1.5倍,30μL/cm喷量效果最佳;NC膜C线、T线的最佳喷量分别为0.8μL/cm、0.6μL/cm;封闭液选择3%BSA的0.01 mol/L PB缓冲液比较合适;经鉴定该试纸条检测限为500 ng/mL,除了与头孢拉定有轻微交叉反应,与头孢噻呋、头孢曲松、头孢噻肟、头孢噻吩、青霉素、链霉素、四环素反应均呈阴性,可在4℃环境中稳定保持180 d。