论文部分内容阅读
【研究目的】本研究选取Dravet综合征（DS）患者SCN1A基因不同位置的截短突变位点，分析相应患者的临床特点，通过构建相关minigene，进行无意义密码子介导的mRNA降解（NMD）机制研究，以探讨在SCN1A基因上不同位置的截短突变能否激发NMD机制，以及研究NMD与临床表型的关系。【研究方法】通过详细收集携带SCN1A基因截短突变的Dravet综合征（DS）患者的临床资料及突变特点，构建融合表达绿色荧光蛋白（GFP）和SCN1A基因截短突变的minigene。通过鉴定不同细胞系内源性抗性基因Kana基因的表达，从而选取无Kana基因表达的人宫颈癌细胞（Hela细胞）、人类神经母细胞瘤株细胞（SH-SY5Y细胞）、NGF诱导的褐家鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（NGF诱导的PC12细胞）作为转染对象，通过脂质体法转染技术，将野生型质粒及截短突变质粒分别转染入上述三种细胞，提取总RNA，经反转录得cDNA，以cDNA为模板，Kana基因及GAPDH基因为内参，进行荧光定量PCR（QPCR）。比较SCN1A基因的野生型及截短突变型质粒在三种细胞中的mRNA相对表达量，每组实验重复三次获得均值。相对定量数据处理采用2-△△Ct法，计量资料以均数±标准差（X±S）表示，采用SPSS l7.0软件包进行统计分析，单因素多样本均数比较采用ANOVA分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。【结果】1．临床资料分析携带c.4526delA，c.4547C>A，c.52805281delTG， c.56215622delGG截短突变位点的患者均诊断为SMEI，携带c.5540-5541insCCAG突变位点的患者诊断为SMEB，无肌阵挛发作类型，其中携带c.5540-5541insCCAG，c.56215622delGG的患者符合孤独症诊断，c.5540-5541insCCAG患者孤独症儿童行为量表（简称ABC量表）78分，儿童孤独症评定量表（简称CARS量表）36分，c.56215622delGG患者ABC量表110分，CARS量表41分。2．PEGFP-C2-SCN1A–minigene野生型及突变型质粒构建和鉴定将表达绿色荧光蛋白及SCN1A基因24至26号外显子的DNA片段（包含25号内含子）连接到PEGFP-C2载体。PEGFP-C2-SCN1A-minigene质粒测序24至26号外显子基因编码区未发现突变，得到野生型minigene，并构建c.4526delA， c.4547C>A， c.52805281delTG， c.5540-5541insCCAG，c.56215622delGG突变型minigene。3.四种细胞系内源性Kana基因表达鉴定HEK293细胞有内源性Kana基因表达，而NGF诱导的PC12细胞,Hela细胞,SH-SY5Y细胞均无內源Kana基因表达。4.荧光定量PCR以Kana基因作为内参基因，Hela细胞中野生型与突变型c.4526delA，c.4547C>A， c.52805281delTG， c.5540-5541insCCAG， c.56215622delGGSCN1A基因mRNA相对表达量分别为1.034±0.337，0.843±0.059（p>0.05），0.898±0.063（p>0.05），1.001±0.184（p>0.05），0.804±0.149（p>0.05），0.784±0.041（p>0.05）；SH-SY5Y细胞中野生型与突变型c.4526delA，c.4547C>A，c.52805281delTG，c.5540-5541insCCAG，c.56215622delGG SCN1A基因mRNA相对表达量分别为1.001±0.073，1.046±0.045（p>0.05），1.078±0.01（p>0.05），1.057±0.037（p>0.05），1.051±0.029（p>0.05），1.204±0.088（p>0.05）；NGF诱导的PC12细胞中野生型与突变型c.4526delA，c.4547C>A，c.52805281delTG，c.5540-5541insCCAG， c.56215622delGG SCN1A基因mRNA相对表达量分别1.01±0.174，0.67±0.118（p<0.05），0.665±0.067（p<0.05），0.684±0.102（p<0.05），0.934±0.046（p>0.05），0.634±0.084（p<0.05）；以GAPDH基因为内参基因，NGF诱导的PC12细胞中野生型与突变型c.4547C>A，c.52805281delTG，c.5540-5541insCCAG， c.56215622delGG SCN1A基因mRNA相对表达量分别1.014±0.173，0.079±0.02（p<0.05），0.3±0.072（p<0.05），0.299±0.075（p<0.05），0.232±0.034（p<0.05）。【结论】1.携带SCN1A基因不同位置的截短突变患者临床症状不完全相同；2.SCN1A基因截短突变所诱发的NMD机制在不同细胞系中表现不同；3.在NGF诱导的PC12细胞中不同位置的截短突变所诱发的mRNA降解量不同，推测可能存在更复杂的机制影响SCN1A基因的表达。