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背景和目的:中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是工业生产重组蛋白类生物药物最主要的细胞株,2016年全球销量排名前十的生物药物中,有7个都是利用CHO系统表达生产的。这主要得益于以下几个方面:CHO细胞具有与人体相似的复杂的翻译后修饰功能,可以进行糖基化等翻译后修饰,从而产生具有良好生物活性的重组蛋白;作为鼠源的CHO细胞可以避免人类细胞特异性病毒的污染;CHO细胞已实现无血清驯化培养和悬浮式高密度生长,能够很好地满足工业生产需求。目前工业构建重组蛋白工程细胞株的一般方法,是将携带有目的基因的载体转染进入宿主细胞,通过多轮的加压筛选及鉴定,最终筛选得到随机整合目的基因并能够高效表达的细胞株。该方法耗时较长,一般需要6~12个月,筛选工作量和难度均较大,此外,由于“位置效应”的影响,随着培养时间的延长,一些高产细胞株会出现产量下降的不稳定现象。通过筛选高效稳定的整合位点,将定点整合技术应用于工业细胞株的建立是解决以上问题的理想途径。CRISPR/Cas9介导的基因定点整合技术,是通过CRISPR/Cas9核酸酶使基因组在特定位点发生双链断裂,当携带有同源臂及外源基因的供体载体存在时,细胞会启动同源末端的修复方式实现外源基因在特定位点的定点整合。利用这种方法可以将外源基因快速、准确的整合到CHO细胞基因组中的转录活跃区。为实现CRISPR/Cas9介导的基因定点整合技术在工程细胞株中的应用,我们首先通过根据文献报道筛选得到了CHO细胞三个潜在的转录活跃区(C12orf35、HPRT、GRIK1位点),利用CRISPR/Cas9介导的基因定点整合技术将编码模式蛋白mCherry和抗体药物anti-PD1的外源基因分别定点整合到这三个潜在位点,经过筛选及鉴定最终得到基因定点整合的稳转细胞株。通过对筛选得到细胞株的生长特性、转录特性、脱靶性及其表达蛋白的产量稳定性和质量特性进行综合评价,我们最终证实利用CRISPR/Cas9介导的基因定点整合技术,在CHO细胞的C12orf35位点定点整合外源基因,能够快速获得稳定、高产的工程细胞株,为生物大分子药物的基础研究及临床开发提供了一种新型、高效的细胞开发手段,具有重要的研究及应用价值。方法:我们首先针对C12orf35、HPRT和GRIK1三个位点分别设计3对sgRNA,通过T7E1酶切实验筛选得到编辑效率最高的一对sgRNA用于后续实验。接着构建同源臂长度为750 bp、带有嘌呤霉素抗性、模式蛋白基因分别为mCherry基因和anti-PD1基因的两种供体质粒,分别与筛选得到的sgRNA编辑质粒共转染到CHO-S细胞。经过3周的嘌呤霉素加压筛选,通过5’/3’junction PCR及蛋白表达鉴定,确认得到阳性细胞池之后,利用有限稀释法铺取单克隆。挑选得到单克隆细胞株后再次进行5’/3’junction PCR及蛋白表达的检测,最终得到基因定点整合的稳转细胞株。针对筛选得到的基因定点整合稳转细胞株,进行生长特性、基因转录水平及脱靶效率的评价。同时检测基因定点整合的稳转细胞株在20代内表达蛋白的产量稳定性。并对anti-PD1基因定点整合的稳转细胞株表达的anti-PD1抗体进行质量评价,包括亲和力和糖基化的检测。结果:通过CRISPR/Cas9介导的基因定点整合技术我们成功实现了mCherry基因和anti-PD1基因分别在C12orf35、HPRT和GRIK1三个位点的定点插入,定点整合效率达到25.4%~66.0%。通过比较野生型CHO-S细胞和基因定点整合稳转细胞株的生长特性我们发现,在C12orf35、HPRT和GRIK1三个位点插入外源基因并不会对细胞的生长特性产生明显影响;通过比较基因定点整合细胞株和随机整合细胞株的转录水平我们发现,在C12orf35、HPRT和GRIK1三个位点插入外源基因也不会对细胞的转录产生明显影响。此外我们比较了基因定点整合稳转细胞株在第5、10、15及20代的mCherry蛋白及anti-PD1抗体的表达水平,结果表明在C12orf35位点整合mCherry基因可以实现mCherry蛋白维持在10000~20000 RFU(红色荧光蛋白平均密度)范围的稳定表达,在C12orf35位点整合anti-PD1基因可以实现anit-PD1抗体维持在110~190 mg/L范围内的表达。对基因定点整合细胞株表达得到的anti-PD1抗体进行亲和力和糖基化检测,结果表明所有检测的细胞株在第5、20代表达得到抗体均具有相同的亲和力和糖型结构。以上指标的评价结果表明,C12orf35位点定点整合所产生的细胞株具有质量和产量的综合优势。此外,全基因组深度测序确证C12orf35位点定点整合所伴随的脱靶效率约为0.175%,且对细胞生长特性及蛋白产品的表达无明显影响。本论文的研究表明,利用CRISPR/Cas9介导的基因定点整合技术在CHO-S细胞的C12orf35位点插入目的基因是一种稳定、可靠、高效的新型细胞株构建方法,具有广泛应用于生物技术药物研发及生产的潜力。