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肠出血性大肠杆菌O157:H7是一种重要的人兽共患性和食源性致病菌,主要通过污染肉制品、奶制品、水等食物进入人体,也可以通过人与人、人与动物的密切接触进行传播。其感染力和致病性很强,引发的感染具有暴发流行性,对人类健康构成极大威胁,已成为全球性的公共卫生问题。空肠弯曲菌是禽类和多种动物肠道内的正常寄居菌,也是一种重要的食源性致病菌,被认为是引起全世界人类细菌性腹泻的主要原因之一,消费者食用被污染的食品(尤其是禽肉)或水后可以引发多种疾病,给公共卫生带来了极大的社会和经济负担。应用特异、灵敏、快速的方法检测食品中这两种致病菌是预防和控制其暴发流行的重要环节。现有检测技术的缺点是:分离培养方法需要增菌,检测时间长;免疫学检测方法需要高质量的抗体,灵敏度和特异性普遍不高;PCR需要昂贵的实验仪器,单纯应用分子生物学检测技术也需要对样品进行前增菌。1.HNB-LAMP检测方法的建立及评价本研究选取EHEC O157:H7和空肠弯曲菌种属特异性靶基因ORF-Z3276、VS1基因分别设计LAMP反应引物,优化反应体系并建立检测这两种菌的HNB-LAMP方法,试验结果表明,所建立的HNB-LAMP方法灵敏度高、特异性强,仅对EHEC O157:H7和空肠弯曲菌呈阳性反应,而对其他大肠杆菌、沙门菌、单核细胞增生李斯特菌等食源性致病菌均为阴性。2.氨基磁珠制备及吸附DNA条件的优化通过共沉淀、反相微乳液及氨基化硅烷偶联剂修饰等步骤制备能稳定吸附DNA的氨基磁珠,优化氨基磁珠吸附DNA的条件,确定了氨基磁珠的最佳吸附p H为7.0,最佳吸附温度为常温,最佳吸附时间为30min,氨基磁珠的添加量随样品性质决定。3.氨基磁珠提取人工污染牛奶肉类致病菌DNA的方法探索出氨基磁珠提取致病菌污染的牛奶和肉类DNA的方法。其中氨基磁珠与人工污染牛奶样品DNA复合物直接加入PCR/LAMP体系进行检测;结合在氨基磁珠表面的人工污染肉类样品需要洗脱DNA,以洗脱液为PCR/LAMP模板进行检测。4.氨基磁珠-LAMP检测方法的建立将氨基磁珠提取DNA与LAMP技术结合,建立EHEC O157:H7和空肠弯曲菌氨基磁珠-LAMP检测方法。该方法检测动物源性食品样品无需增菌,从样品处理到LAMP结果判定整个检测流程仅需4.5h。氨基磁珠-LAMP方法检测EHEC O157:H7人工污染牛奶、猪肉样品的灵敏度为60 CFU,而氨基磁珠-PCR方法的灵敏度为600CFU;氨基磁珠-LAMP方法检测空肠弯曲菌人工污染鸡肉样品的灵敏度为80 CFU,而氨基磁珠-PCR方法的灵敏度为800 CFU。综上表明,氨基磁珠-LAMP检测方法是一种检测程序简单、成本低廉、灵敏度和特异性高的新型检测技术,在EHEC O157:H7和空肠弯曲菌的快速检测方面有一定开发潜力,为有效监督和控制动物源性食品中EHEC O157:H7和空肠弯曲菌构建了一个新的技术平台。