神经退行性疾病包括帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)等。这些疾病均有报道可使神经元发生退行性病变和凋亡，导致疾病发生。近年来，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal protein kinase．JNK)和糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3，GSK-3β)被报道可能参与了神经退行性疾病的发病过程中的神经元凋亡。因此我们试图通过使用可同时抑制这两种激酶的一种抑制剂，来阻断它们，从而保护性干预神经元的凋亡，达到防治这类疾病的目的。通过对多种化合物的筛选，我们关注到一个符合上述条件的药物：靛玉红衍生物(indirubin-3’-oxime，IO)。本篇论文主要探讨其对神经元的保护作用及机制。 1．IO对中脑多巴胺能神经元的保护作用 用1-甲基-4-苯基-1，2,3,6-四氢吡啶(MPTP)30mg/kg每日腹腔注射一次，连续给药五天的方法建立PD小鼠模型。利用免疫荧光双染色检测小鼠酪氨酸羟化酶(TH)染色阳性的黑质神经元内GSK-3β和其底物Tau的磷酸化水平、TH的ABC染色法统计黑质内残余神经元的数目，高效液相测量纹状体多巴胺含量以及通过爬杆实验，僵直实验和游泳实验测试小鼠行为改变。结果显示：连续注射MPTP降低TH神经元内GSK-3βSer9位点的磷酸化，升高底物Tau的Ser396位点磷酸化，并使中脑黑质内TH阳性多巴胺能神经元数目减少为正常的55.5﹪，纹状体内多巴胺含量由正常的0.647ng/mg显著降低到0.158 ng/mg和导致小鼠肢体协调功能障碍。而特异性抑制GSK-3β的AR-A014418可降低GSK-3β活性，使黑质内残余功能神经元的数目呈浓度依赖性的增加，提升纹状体组织内的多巴胺含量，并改善了MPTP处理小鼠的肢体协调能力。这些结果首次证实GSK-3β的激活很可能介导了MPTP诱导的多巴胺能神经元死亡。 通过同样的实验方法也发现3、10、30mg/kg的IO预处理能剂量依赖地提升MPTP降低的多巴胺神经元数目(从MPTP组的55.5﹪分别提升到75.8﹪、86.2﹪、92.3﹪)。30mg/kg的IO还可显著提升纹状体多巴胺含量到0.408ng/mg和改善MPTP处理小鼠的肢体协调能力。另外，在1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP<'+>)诱导体外培养多巴胺神经元死亡的PD细胞模型上0.5、1.3μM的IO也可浓度依赖性提升MPP<'+>降低的TH阳性神经元数目(从MPP<'+>组的37.1﹪分别提升至64.1﹪、74.5﹪、65.3﹪)。 在小鼠体内的进一步实验发现IO可以降低MPTP诱导的JNK和GSK-3β的底物c．Jun蛋白和Tau蛋白的磷酸化。 上述实验结果显示：GSK-3β的激活很可能介导了MPTP诱导的多巴胺能神经元死亡；IO对PD细胞模型和动物模型中的多巴胺能神经元有很好的保护性干预作用，可以改善PD动物模型的一系列病理、生化和行为学改变。这种作用很可能是通过抑制JNK和GSK-3β的激活而产生的。 2．IO对小脑颗粒神经元的保护作用 为了深入研究10保护神经元的机制，我们在低钾诱导小脑颗粒神经元凋亡模型上利用Hoechst 33258核染色和Western blot发现：把体外培养的小脑颗粒神经元从含去极化浓度钾离子(25mM KCl)的培养基转移至低钾培养基(5mM KCI)12h后可诱导42﹪的小脑颗粒神经元凋亡；低钾可升高JNK(Ser183/Thr186)及其底物c-Jun(Ser73)蛋白的磷酸化，降低p-GSK-3β(Ser9)和GSK-3β的底物β-catenin的表达，并上调CDK5异常激活子p25；JNK通路的抑制剂(CEP11004和SP600125)，GSK-3β的抑制剂(SB415286)和CDK5的抑制剂(Olomoucine和Roscovitine)都能够明显减少低钾环境中培养的小脑颗粒神经元的凋亡率。 用上述相同的方法我们还发现，IO可剂量依赖地降低低钾所诱导的小脑颗粒神经元凋亡，1、3、10μM的IO可使神经元的凋亡率从低钾组的43﹪分别降低到23.1﹪、14.0﹪、15.7﹪。IO还可降低JNK底物c-Jun(Ser73)的磷酸化，提升低钾诱导的β-catenin表达下调，并抑制低钾引起的CDK5异常激活子p25升高。 以上的实验结果提示：JNK，GSK．3B和CDK5/p25都很可能参与了低钾诱导的小脑颗粒神经元的凋亡过程；IO可干预低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡，这种神经保护作用很可能是通过抑制低钾引起的JNK和GSK-3β激活以及p25上调所致。 3．IO对大脑皮层神经元的保护作用 探讨了IO对秋水仙碱诱导大脑皮层神经元死亡模型的保护作用。通过形态学，LDH释放量检测，Hoechst 33258核染色及DNA Ladder电泳证实秋水仙碱可诱导大脑皮层神经元死亡，且该死亡为典型的凋亡。微管稳定剂Taxol可减少秋水仙碱诱导的神经元凋亡核形态和DNA Ladder出现，提示凋亡的发生可能是由于微管受损而启动的。应用Western blot方法发现秋水仙碱处理大脑皮层神经元后6h，磷酸化JNK和磷酸化p38均增高(分别为正常的220﹪和245﹪)；这两种激酶各自的特异性抑制剂都可以浓度依赖性地抑制它们的磷酸化并且降低神经元凋亡率。 IO可剂量依赖地降低秋水仙碱诱导的大脑皮层神经元凋亡，3和10μM的IO可将神经元的凋亡率从秋水仙碱组的56.3﹪分别降低到44.2﹪和28.3﹪，并且抑制了JNK的底物c-Jun的磷酸化。 上述实验结果提示JNK和p38的激活可能参与了秋水仙碱对皮层神经元的毒性作用；IO对秋水仙碱诱导的皮层神经元凋亡模型有保护性干预作用，这一作用可能是通过抑制JNK激酶来发挥的。 结论： 1．IO对MPTP/MPP<'+>诱导PD动物或细胞模型的黑质多巴胺能神经元死亡，低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡以及秋水仙碱诱导的大脑皮层神经元凋亡有保护性干预作用； 2．JNK的激活是三种细胞模型中神经元死亡过程中所必需的，而IO很可能通过抑制JNK从而保护神经元； 3．GSK-3β的激活介导了MPTP对黑质神经元和低钾对小脑颗粒神经元的毒性作用，IO很可能通过抑制该激酶的激活从而发挥其神经保护作用； 4．p25的表达上调引起的CDK5异常激活可能参与了低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡，IO可能因为阻止低钾增高的p25而保护神经元； 5．p38的激活很可能参与了秋水仙碱诱导的大脑皮层神经元凋亡。