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前言随着社会经济的发展以及人们生活水平的提高,全球糖尿病及肥胖患者发病率急剧增加。肥胖、糖尿病等代谢性疾病逐渐成为危害人类健康的重要因素。糖尿病血管并发症是糖尿病患者致残、致死的主要原因,其中血管内皮细胞功能异常是糖尿病血管并发症的早期病理改变。体外研究显示高糖可以诱导血管内皮细胞凋亡,提示血管内皮细胞凋亡与糖尿病血管并发症密切相关。除高糖外,大量研究证实肥胖及2型糖尿病患者体内游离脂肪酸(Free fatty acid,FFA)水平明显升高。软脂酸(Palmitic Acid, PA)作为游离脂肪酸主要成分之一,不仅可以导致胰岛素抵抗(Insulin Resistance, IR),还能够引起血管内皮细胞功能失调、动脉粥样硬化及炎症反应。多种信号通路参与细胞增殖、凋亡的调节,细胞外信号调节激酶1/2-结节性硬化症复合体-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物(ERK1/2-TSC-mTOR)是调节细胞增殖与凋亡的经典通路,因此推测ERK1/2-TSC-mTOR亦可能在糖尿病血管并发症中具有重要影响。护骨素(Osteoprotegerin,OPG)是肿瘤坏死因子受体超家族的成员,其主要作用是与RANK竞争性结合RANKL,阻断破骨细胞分化与吸收。除此之外,OPG还可以与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)竞争,阻止细胞膜相关死亡受体(DR4、DR5)触发的多种细胞凋亡。因此,近年来大量研究表明OPG还是一种重要的血管调节因子。国内外临床研究发现,糖尿病患者体内护骨素水平显著增高,与糖尿病血管并发症及血管内皮功能异常密切相关。但护骨素对血管内皮细胞的具体影响及机制目前尚不明确。因此,我们假设护骨素能够对软脂酸诱导的血管内皮细胞损伤起到保护作用。为此我们将从以下方面进行研究：(1)通过建立体外软脂酸诱导的人脐静脉内皮细胞损伤模型,探讨护骨素对软脂酸诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用；(2)通过检测ERK1/2-TSC-mTOR信号通路蛋白表达情况,来探讨护骨素保护软脂酸诱导损伤的血管内皮细胞的可能机制。本实验旨在为糖尿病血管并发症的发生机制及为护骨素在未来治疗糖尿病、预防糖尿病血管病变等方面的应用提供实验依据。材料与方法一、实验材料HUVECs株(ATCC CRL-2873).软脂酸、无脂肪酸牛血清白蛋白、二甲基亚砜,抗体(ERK1/2, P-ERK1/2, Tuberin, P-Tuberin, S6K, P-S6K, Bcl-2, Bax)、局糖DMEM培养基、重组人OPG、PD98059、胎牛血清等。二、实验方法1.软脂酸诱导的血管内皮细胞损伤模型的建立将人脐静脉内皮细胞随机分为2组：①正常对照组(0.4%无脂肪酸牛血清白蛋白)；②软脂酸组(浓度分别为0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.8mmol/L),以上各组细胞均培养24h及48h后进行收集,采用MTT比色法检测软脂酸对人脐静脉内皮细胞增殖的影响,流式细胞术检测软脂酸对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响,Hoechst33258观察各组细胞的细胞核形态学变化。2.护骨素对软脂酸诱导损伤的血管内皮细胞的保护作用将人脐静脉内皮细胞分为3组：①正常对照组(0.4%无脂肪酸牛血清白蛋白)；②软脂酸组(浓度为0.4mmol/L)；③护骨素组(不同浓度护骨素预处理24h,再加入0.4mmol/L软脂酸,护骨素浓度分别为50μ g/L、100μ g/L、200μ g/L、400μg/L)。各组细胞均培养24h,采用MTT比色法检测软脂酸对人脐静脉内皮细胞增殖的影响,流式细胞术检测软脂酸对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响,Hoechst33258观察各组细胞的细胞核形态学变化。3.护骨素对软脂酸诱导血管内皮细胞保护作用的机制研究将人脐静脉内皮细胞分为5组：①正常对照组；②软脂酸组(0.4mmol/L PA)；③护骨素组(400μ g/L OPG±0.4mmol/L PA)；④护骨素+PD98059组(20μ mol/LPD98059+400μg/L OPG+0.4mmol/L PA);⑤软脂酸+PD98059组(20μ mol/LPD98059+0.4mmol/L PA)。上述不同干预因素处理的细胞培养24小时后,采用Western blot分析各组细胞的细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(P-ERK1/2)、马铃薯球蛋白(tuberin)、磷酸化马铃薯球蛋白(P-tuberin)、核糖体蛋白S6激酶(S6K)、磷酸化核糖体蛋白S6激酶(P-S6K)以及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达水平。4.统计学分析应用SPSS13.0统计软件进行分析,数据资料用均数±标准差(x±s)表示。组间均数比较采用方差分析,组间两两比较采用LSD法,多因素比较采用析因分析。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.软脂酸诱导的血管内皮细胞损伤模型的建立1)血管内皮细胞形态学：倒置相差显微镜下观察血管内皮细胞形态学变化正常状态下,人脐静脉内皮细胞在4h时可见部分细胞贴壁,伸出伪足；24h时,细胞几乎完全贴壁,呈单层排列,边界清楚,细胞呈现圆形、梭形或扁平多角形；3-4d融合成单层,如铺路石镶嵌排列,有些细胞则呈鱼贯状相连,间有旋涡状排列；5～6d细胞生长融合成致密单层,细胞生长缓慢。软脂酸培养24h的人脐静脉内皮细胞逐渐变大变圆,部分细胞从支持物上脱落,随着软脂酸诱导细胞时间的延长,脱落细胞逐渐增多。2)血管内皮细胞增殖：MTT比色法检测软脂酸诱导的内皮细胞增殖与正常对照组相比,软脂酸组人脐静脉内皮细胞活性明显被抑制(P<0.05),且与同一软脂酸浓度组细胞OD值比较,随着时间延长细胞活性下降,提示软脂酸呈剂量-时间依赖性的抑制细胞增殖。3)血管内皮细胞凋亡：流式细胞术(Annexin V-FITC/PI双染法)检测软脂酸诱导的内皮细胞凋亡率与正常对照组相比,软脂酸组人脐静脉内皮细胞凋亡率显著增加(P<0.05),该趋势具有软脂酸剂量依赖性。4)血管内皮细胞核形态变化：Hoechst33258核染色检测软脂酸对内皮细胞核形态的影响各组细胞经DNA荧光染料Hoechst33258染色后,在荧光显微镜下观察细胞核形态变化。正常对照组细胞核DNA分布相对均匀,核无固缩,在视野中呈现体积较大的浅染核形态；而软脂酸组细胞核DNA浓聚,胞核出现不同程度的固缩,在视野中呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染的深染核形态,有凋亡细胞核的典型特征。2.护骨素对软脂酸诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用1)血管内皮细胞增殖：MTT比色法检测护骨素对软脂酸诱导的人脐静脉内皮细胞增殖的影响与正常对照组相比,软脂酸组细胞增殖显著降低(P<0.05)；而给予护骨素处理后,则剂量依赖性的抑制软脂酸诱导的细胞活性下降(P<0.05)。2)血管内皮细胞凋亡：流式细胞术(Annexin V-FITC/PI双染法)检测护骨素对软脂酸诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响与正常对照组相比,软脂酸组血管内皮细胞凋亡率明显增加(P<0.05)；护骨素组细胞凋亡率明显低于软脂酸组(P<0.05),且呈护骨素浓度依赖性。3)血管内皮细胞细胞核形态变化：Hoechst33258染色观察护骨素对软脂酸诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响各组细胞经DNA荧光染料Hoechst33258染色后,在荧光显微镜下观察细胞核形态变化,每组细胞各取3个视野,每个视野至少统计50个细胞核,计算平均凋亡率。结果显示,正常细胞核内DNA分布相对均匀,核无固缩,在视野中呈现体积较大的浅染核形态,而凋亡细胞核内DNA浓聚,核出现不同程度的固缩,在视野中呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染的深染核形态,有细胞凋亡的典型特征。正常对照组有少量细胞凋亡；与正常对照组比较,软脂酸组凋亡细胞核明显增多(P<0.05)；护骨素组细胞凋亡较软脂酸组减少(P<0.05),且呈护骨素剂量依赖性。3、护骨素对软脂酸诱导的血管内皮细胞保护作用的机制为探讨ERK-TSC-mTOR信号传导通路在护骨素保护软脂酸诱导损伤的人脐静脉内皮细胞中的作用,我们采用Western blot检测ERK-TSC-mTOR信号通路蛋白表达情况。1) mTOR上游蛋白表达：与正常对照组比较,软脂酸组P-ERK1/2及P-tuberin表达水平显著增高(P<0.05)；给予护骨素后,P-ERK1/2、P-tuberin表达水平明显低于软脂酸组(P<0.05)；而给予ERK抑制剂PD98059阻断ERK通路后,护骨素+PD98059组及软脂酸+PD98059组P-ERK1/2、P-tuberin表达均较同因素无PD98059组表达下降(P<0.05)。2) mTOR下游蛋白表达：与正常对照组比较,软脂酸组P-S6K表达水平显着增高(P<0.05)；给予护骨素后,P-S6K表达水平明显低于软脂酸组(P<0.05)；护骨素±PD98059组及软脂酸+PD98059组P-S6K表达水平均较同因素而无PD98059组下降(P<0.05)。3)凋亡相关蛋白表达：与正常对照组比较,软脂酸组Bax表达水平增高(P<0.05),Bcl-2表达降低(P<0.05)；护骨素则使Bax表达水平明显低于软脂酸组(P<0.05),Bcl-2表达明显高于软脂酸组(P<0.05)。结论1、软脂酸能够诱导人脐静脉内皮细胞损伤,呈软脂酸浓度依赖性。2、软脂酸通过上调ERK1/2-TSC-mTOR活性,进而降低Bcl-2表达、增加Bax表达,最终导致血管内皮细胞凋亡。3、护骨素对软脂酸诱导损伤的人脐静脉内皮细胞具有保护作用,该作用呈护骨素浓度依赖性。4、护骨素通过下调ERK1/2-TSC-mTOR活性,增加Bcl-2表达、降低Bax表达,从而拮抗软脂酸诱导的血管内皮细胞凋亡。