论文部分内容阅读
目的：建立一种简单的、稳定的大鼠糖尿病足模型，应用骨髓干细胞（bonemarrow stem cell,BMSC）移植治疗大鼠糖尿病足，观察其治疗效果。应用免疫组化技术评价治疗后患肢局部肌肉组织微血管密度，并检测血管内皮生长因子（vascular endothelial cell growth factor,VEGF）表达水平；应用逆转录—聚合酶链反应（Reverse transcription-Polymerase chain reaction,RT-PCR）技术检测血管生成素I（angiopoietin,Ang-I）表达水平。方法：1.健康雄性Wistar大鼠30只，随机分为实验组（n=25）与对照组（n=5），高糖高脂饮食喂养4周。2.实验组大鼠给予腹腔注射链脲佐菌素（STZ）45mg/kg，对照组给予腹腔注射与实验组同等剂量的柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液；3天后测量空腹血糖，血糖≥16mmol/l为糖尿病模型造型成功。3.糖尿病成模大鼠予以行左下肢股动脉结扎术，建立糖尿病足模型。4.常规取健康Wistar鼠股骨、胫骨骨髓血，应用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞（bone marrow mononuclear cell,BMMNC）。5．配制×10~6/mlBMMNC悬液以备用。6．将糖尿病足成模鼠8只随机分为3组，组（n=6）为鼠模型非治疗组；B组(n=6)为鼠模型治疗组，予BMMNC悬液注射；C组(n=6)为鼠模型假治疗组，予注射PBS液。7．监测3组大鼠不同时间的空腹血糖、体重、饮水量以及尿量变化。于干细胞局部移植治疗28天后取缺血下肢局部肌肉组织，制作切片，行免疫组织化学染色，评价血管密度、检测VEGF表达水平，并应用RT-PCR技术检测Ang-I在缺血患肢局部的表达水平。结果：1．25只实验组大鼠注射STZ3天后，有19只大鼠空腹血糖≥16mmol/l，并有多饮、多尿、多食、消瘦等症状；补注STZ7天后全部大鼠血糖≥16mmol/l。死亡4只。21只糖尿病成模鼠行左下肢股动脉结扎术6d后，5只死亡，余16只作为DF鼠模型进入第2部分实验，死亡4只，共12只完成实验全过程。所有鼠模型股动脉结扎3天后，缺血后肢均逐渐出现不同程度的萎缩以及活动力下降。所有鼠模型在处死取材时，缺血后肢均无明显坏疽出现。2．BMMNC患肢局部移植后免疫组化染色vWF计数微血管，A组4.667±0.577，B组7.25±0.5，C组4.3±0.819。B组微血管数量明显高于A、C两组，P<0.05。3．BMMNC患肢局部移植后，患肢肌肉组织中VEGF蛋白表达量，A组123.55±15.70，B组194.55±16.34，C组120.17±14.87。B组VEGF蛋白表达量高于A、C组，P<0.05，具统计学意义。4．BMMNC患肢局部移植后，组织Ang–ImRNA提取质量，A组0.482±0.017，B组1.173±0.028，C组0.474±0.016，B组值明显高于A、C组，P<0.05。结论：1．高糖高脂饮食4周可诱发大鼠胰岛素抵抗，同时合并给予小剂量STZ （45mg/kg）腹腔注射，部分破坏胰岛β细胞，此方法可诱导出与人类2型糖尿病接近的动物模型。糖尿病鼠行股动脉结扎术可以很好的模拟糖尿病足患者发病机制之一血管闭塞性缺血，但是不能完全反映出糖尿病足的多种因素共同作用的这一特点。2．BMMNC可通过采集骨髓血，密度梯度离心法获得，行缺血局部肌肉组织移植后，可以稳定归巢到受损组织，参与缺血组织局部的血管重建过程，使缺血患肢的局部供血得到明显改善。3．行BMMNC患肢局部移植后，缺血患肢局部肌肉组织中vWF计数明显高于对照组，其差异有统计学意义。4.行BMMNC局部移植治疗后患肢局部肌肉组织的VEGF蛋白表达量明显高于未行治疗的对照组，差异有统计学意义。5.DF大鼠患肢局部BMMNC移植后局部肌肉组织中Ang–ImRNA提取质量明显高于对照组，差异有统计学意义。6．骨髓干细胞移（bonemarrow stem cell transplant,BMSCT）治疗DF的疗效机制可能是：一方面，在移植治疗后多种干细胞成分在归巢至缺血组织局部分化成为血管内皮细胞(endothelialcell,EC)，而后进一步演变为毛细血管，最后逐渐塑形成小的侧支血管；另一方面通过自分泌和旁分泌形式产生VEGF、Ang–I等多种因子，诱导机体血管内皮组细胞（endothelial progenitor cell,EPC）的产生与释放，从而多途径的促进缺血局部血管新生，加速血管构建。