基于核酸适体的微流控芯片肿瘤细胞富集与检测平台的建立

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本论文主要是针对急性早幼粒细胞白血病肿瘤细胞建立微流控芯片富集和分子生物学检测技术平台。整本论文主要可分为两个部分。其中第一部分主要针对急性早幼粒细胞白血病的肿瘤标志物建立实时荧光PCR分子生物学检测体系。第二部分主要针对急性早幼粒细胞白血病肿瘤细胞建立基于核酸适体的微流控芯片富集与检测平台。  第一章为绪论,通过阅读大量的文献和资料,综述了本论文开展的研究中所涉及的主要领域。包括:白血病的介绍和其检测技术的发展、富集和检测循环肿瘤细胞的主要技术、核酸适体的简要介绍及其发展应用。  第二章主要针对急性早幼粒细胞白血病的肿瘤标志物建立实时荧光PCR分子生物学检测体系。在本章中主要针对普遍存在于此类白血病细胞系中的PML-RARA融合基因建立实时PCR检测体系。首先用构建的PML-RARA融合基因L型融合形式的阳性质粒筛选出了最优的引物和探针组合,然后通过优化实时PCR体系的各种成分确定了最优的实时PCR体系。最后用阳性质粒、NB4细胞系cDNA(含有PML-RARA融合基因)及U266细胞系cDNA(阴性对照)作为模板,比较了普通引物(不加尾)和加尾引物体系的灵敏度和特异性,最终确定了最优的实时PCR检测体系。结果表明实验中建立的最优实时PCR体系不仅具有很高的灵敏度(可达到10拷贝),而且具有良好的特异性。  第三章主要针对急性早幼粒细胞白血病肿瘤细胞建立基于核酸适体的微流控芯片富集平台,并用实时PCR技术对富集细胞进行检测。在本章中,首先用流式细胞术和芯片上的细胞捕获效果筛选出了一条与NB4细胞系具有高亲和力和良好特异性的核酸适体。然后根据实验室现有条件优化了细胞捕获实验中的几个参数,使细胞捕获效率得到显著提高。最后对人工制备的细胞混合样品(掺杂不同数量的NB4细胞和对照U266细胞)进行捕获,并将细胞从芯片通道中释放下来进行核酸水平的检测。结果表明,本实验中建立的微流控芯片平台对NB4细胞的捕获效率可达到80%左右。在DNA水平的检测中,含有101个NB4细胞的样品在实时PCR中可产生较强信号,表明本实验中建立的微流控芯片平台具有较强的细胞处理能力;而在RNA水平的检测中,PML-RARA融合基因实时PCR体系能在掺杂有102个NB4细胞的混合细胞样品中检测到较强信号。结合核酸适体的良好特异性和对NB4细胞系的高亲和力,以及实时PCR技术在核酸水平上检测的良好灵敏度,表明本论文中建立的微流控芯片肿瘤细胞富集与检测平台在白血病微小残留病的检测中具有较好的应用潜力。
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